Существуют ли фотолюминесцентные наночастицы на основе графеновых квантовых точек и химерных пептидов?


Разработка подходящих наноносителей для одновременной доставки и отслеживания генов является одним из приоритетных направлений исследований в молекулярной медицине. Нетоксичные графеновые квантовые точки (GQDs) с двумя различными (зеленым и красным) цветами эмиссии синтезированы по методу Хаммера и охарактеризованы с помощью УФ-Вида, фотолюминесценции (ФЛ), ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (ИК-Фурье) и Рамановской спектроскопии, атомно-силовой микроскопии (АСМ), сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

Введение

GQDs конъюгированы с химерным пептидом MPG-2H1 и плазмидной ДНК (pDNA) посредством нековалентных взаимодействий. После конъюгации средний диаметр приготовленных GQDs увеличился с 80 нм до 280 нм в структуре комплекса, а ζ-потенциал комплекса увеличился (с -36,87 до -2,56 мВ). Высокая эффективность трансфекции наноносителя и результаты конфокальной микроскопии показали, что наша конструкция может рассматриваться как нетоксичный носитель с двойными функциями для доставки генов и ядерного таргетинга.

Появление генной терапии в начале 1990-х годов вызвало огромную революцию в области молекулярной медицины и впервые в истории наук о жизни создало эффективную стратегию для лечения генетических заболеваний, таких как рак. В целом, генная терапия относится к ряду терапевтических подходов, при которых генетический материал переносится в определенные клетки организма пациентов с целью исправления и устранения генетических дефектов. Хотя в этой области было предпринято много усилий, генная терапия все еще находится на ранней стадии развития, и даже в прошлом она сопровождалась поражениями. Идентификация терапевтического гена и его эффективная доставка в ядро нужных клеток, а также его отслеживание являются ключевыми факторами успешного процесса генной терапии. 1,2,3,4,5

Подходящий наноноситель для генной терапии должен обладать высокой эффективностью, отсутствием цитотоксичности и иммуногенности, способностью переносить ген и защищать его от деградации, преодолевать биологические барьеры и доставлять ген. 6,7,8,9,10

В настоящее время невирусные векторы, такие как катионные липиды и полимеры, например, полипептиды, рассматриваются как безопасная замена вирусным векторам из-за отсутствия вредных эффектов, включая цитотоксичность и иммуногенность. Поэтому в настоящее время ведется активная работа по поиску новых невирусных наноносителей для эффективной доставки терапевтических генов в нужные клетки. Одним из наиболее важных носителей, используемых для переноса генов в клетки, являются слитые нанопептиды, способные конденсировать ДНК, разрушать мембраны эндосом и усиливать транслокацию ДНК в ядро. 11, 12

Химерные пептидные векторы, используемые в данном исследовании, состоят из трех различных мотивов, которые отвечают за три специфические характеристики, упомянутые выше, для преодоления биологических барьеров на пути переноса генов в клеточное ядро. Этот пептид был ранее разработан в нашей лаборатории. 8

Первый мотив представляет собой 16-мерную пептидную последовательность, содержащую положительно заряженные аминокислоты, такие как лизин и аргинин (ATPKKKSTKKKTPKKAKK), которые способны связывать и конденсировать молекулу ДНК за счет электростатических взаимодействий. Основная роль этого мотива заключается в конденсации и изменении размера молекулы ДНК от микрометра до нанометра, чтобы облегчить ее проникновение в клетки путем эндоцитоза.

Второй мотив (GALFLGFLGAAGSTMGA) играет ключевую роль в нарушении эндосомальной мембраны и ускорении эндосомального выхода сконструированных комплексов в цитозоль и, следовательно, в защите от эндосомальных нуклеаз и пептидаз. Пептиды, содержащие этот мотив, известны как "пептиды слияния". Третий мотив - сигнал ядерной локализации (NLS) (PKKKRKVA), который направляет нужный пептид к ядру через комплексы ядерной поры (NPC). 7,8,9

Учитывая предыдущие исследования по эффективной доставке генов, последние разработки в области наномедицины и появление различных стратегий отслеживания, сделали возможным одновременное отслеживание и наложение терапевтических эффектов генетических агентов. Основной проблемой является разработка носителя, который бы отвечал всем критериям, включая высокую эффективность трансфекции, преодоление клеточных барьеров, эффективное высвобождение груза, отсутствие токсичности и стимуляции иммунной системы, а также возможность отслеживания доставленного груза. Поэтому разработка эффективных процедур с высокой точностью и чувствительностью может стать многообещающим шагом на пути решения современных проблем генной терапии. Флуоресцентные методы являются подходящими стратегиями для быстрой, тщательной и чувствительной молекулярной визуализации. Кроме того, эти методы позволяют осуществлять мультиплексное обнаружение флуоресцентных зондов с нанометровым разрешением. 13, 14

Несколько исследований показали широкое применение различных флуоресцентных агентов, включая органические флуорофоры и флуоресцентные белки для биологической визуализации и отслеживания биомолекул. Органические флуорофоры могут проникать в биологические структуры и позволяют наносить биометки и впоследствии отслеживать их без вмешательства в их биологические функции. 14,15,16,17,18

Однако низкая яркость, низкая фотостабильность, асимметричный и широкий спектр флуоресценции, флуоресцентное мерцание и трудная функционализация ограничивают их применение. Флуоресцентные белки имеют некоторые ограничения по сравнению с органическими красителями из-за их особых фотофизических свойств. Например, мерцание, низкая яркость и фотостабильность, ограниченность цветов и химического состава, зависимость флуоресценции от типа клетки. Кроме того, агрегация флуоресцентных белков или генерируемые свободные радикалы при увеличении времени воздействия на клетки могут вызывать цитотоксичность. 19

Квантовые точки (QDs) как новые флуоресцентные зонды для биологической визуализации и отслеживания, преодолели ограничения органических флуорофоров и флуоресцентных белков. Было проведено несколько исследований по доставке генов и их отслеживанию с помощью QDs. Srinivasan и др. разработали наноструктуры пДНК, меченной фосфолипидным покрытием CdSe/ZnS QDs, для отслеживания генов. Полученный ими комплекс позволяет проводить трансфекцию генов и отслеживать их поглощение клетками. В другом исследовании изучалась конъюгация PEGylated QDs с siRNA и пептидом F3 и отслеживалась доставка siRNA путем визуализации присоединенных QDs под флуоресцентным микроскопом.. 18,19,20,21

Несмотря на очевидные преимущества, одним из основных препятствий для полупроводниковых QDs является их цитотоксическое действие в биологических системах, обусловленное утечкой тяжелых металлов. Поэтому их применение в молекулярном и клеточном отслеживании было ограничено. При определении уровня токсичности QDs важны различные факторы, включая размер, заряд, концентрацию, растворимость в водном буфере, агенты покрытия и др. Несмотря на многочисленные исследования по оптимизации этих факторов для эффективного применения QDs в биологических системах, токсичность этих нанокристаллов все еще остается серьезной проблемой. Поэтому были подняты вопросы о новых квантовых точках без токсичных ионов. 20,21,22,23

Наиболее важными из них являются графеновые квантовые точки (ГКТ), которые привлекают все большее внимание многих исследователей. GQDs были обозначены как нульмерные графеновые листы (0D), с поперечными размерами менее 100 нанометров в одном, двух или нескольких слоях. Высокая фотолюминесценция и биосовместимость, оптическая и химическая стабильность, простота функционализации биомолекулами, а также нецитотоксичность этих наночастиц сделали их очень перспективными люминесцентными зондами для биологической визуализации и отслеживания. В целом, существует две стратегии синтеза GQDs: сверху вниз и снизу вверх. Методы "сверху вниз" включают в себя разрезание графена на более крупные материалы до GQDs, широко используются исследователями из-за их простой методологии и высокого выхода. 24,25,26,27,28,29,30, 31, 32

В данном исследовании мы синтезировали GQDs методом Хаммера, как одним из наиболее известных методов "сверху вниз", с двумя различными размерами и, следовательно, двумя различными (зеленым и красным) цветами эмиссии из графитового источника. Как показано на рис. 1Сначала мы приготовили комплекс из плазмидной ДНК (пДНК) и химерного пептида MPG-2H1, который затем нековалентно прикрепили к GQDs. Наконец, приготовленные нанокомплексы были успешно трансфецированы в клеточные линии HEK 293 T в качестве модели для качественной и количественной оценки эффективности трансфекции генов, доставки ДНК в ядро и отслеживания.

Рисунок 1: Схематическое изображение сборки комплексов MPG-2H1/pDNA/GQDs посредством нековалентных взаимодействий, трансфекции в клетки и возбуждения.

Результаты и обсуждение

Характеристика GQDs

УФ/Вид спектроскопия поглощения синтезированных GQDs выявила плечо поглощения в видимой области при 320 нм, которое связано с n-π* переходом, и сильное поглощение при 230 нм, связанное с π-π* переходом (рис. 2A), аналогично предыдущим исследованиям для GQDs. Характерные полосы поверхностных функциональных групп на GQDs, соответствующие эпоксиду, C=O и O-H, были обнаружены с помощью ИК-Фурье спектроскопии (рис. 2B). На рис. 2C показан рамановский спектр графита и GQDs. Наблюдаются два основных пика: D-пик при 1301 см-1 и G-пик при 1524 см-1. Относительная интенсивность D-пика к G-пику (ID/IG) для GQDs и графита составляет 0,97 и 0,71, соответственно. Высокое отношение ID/IG в GQDs указывает на большие нарушения и структурные дефекты в полученных GQDs. 33,34,35

Рисунок 2: УФ-Вид спектр поглощения (A) ИК-Фурье спектр (B) Рамановский спектр (C) и спектры фотолюминесценции (D и E) GQDs.

Несколько характеристик этих наночастиц, включая квантовое ограничение и краевые эффекты, поверхностные дефекты и свободные зигзагообразные участки в GQDs, были рассмотрены как источник их флуоресценции. Спектр ПЛ синтезированных GQDs демонстрировал флуоресценцию, зависящую от возбуждения. При увеличении длины волны возбуждения от 350 до 500 нм и от 520 до 620 нм максимум эмиссионного пика смещался от 500 до 570 нм и от 575 до 675 нм, соответственно. Кроме того, при изменении длины волны возбуждения изменялась и интенсивность ПЛ; максимум эмиссии наблюдался при 500 нм при возбуждении при 400 нм, тогда как при возбуждении при 520 нм пик эмиссии наблюдался при 575 нм (рис. 2D и E). 34, 36, 37

На рисунке 3A показано типичное АСМ-изображение GQDs. Как показано на правом нижнем изображении на рис. 3А, средняя топографическая высота GQDs составляет <1 нм (около 0,7 нм), что указывает на то, что синтезированные GQDs состоят из одного графенового слоя.. АСМ и СЭМ (рис. 3В) характеристики показали, что средний размер GQDs составляет около 80 нм. Средний размер малых и больших GQDs на РЭМ-изображении, определенный с помощью программы imagJ, составляет около 68 нм и 100 нм, соответственно. Кривая нормального распределения и график гистограммы были построены с помощью программы Minitab 16. Синтезированные GQDs показали две четкие полосы на геле электрофореза агарозы (рис. 3C), что согласуется с данными АСМ и анализом распределения размеров GQDs на СЭМ и демонстрирует, что двухцветные эмиттерные GQDs были успешно получены. 38

Рисунок 3: AFM топографическое изображение GQDs (A), нижнее изображение показывает распределение GQDs по высоте. СЭМ изображение и анализ распределения размеров GQDs (B). Разделение двух популяций свободных GQDs с помощью электрофореза на агарозном геле 1% (C).
Экспрессия пептида MPG-2H1

На С-конце пептида MPG-2H1 имеется хвост His-tag, который позволяет проводить очистку с помощью смолы Ni-NTA. Как было описано ранее, плазмида pET28a, содержащая ген, кодирующий слитый пептид, экспрессируется в E. coli C41 (DE3) plysS. Затем была проведена очистка с помощью Ni-NTA смолы под градиентом мочевины. На рисунке 4A показан очищенный пептид в виде одной полосы в геле 15% SDS-PAGE.

Рисунок 4. Очищенный пептид, окрашенный синим Коомасси, в SDS-PAGE 15% (MW.14 кДа) (A). Анализ нативного замедления акриламидного геля (PAGE 15%) MPG-2H1, MPG-2H1/пДНК и комплекса MPG-2H1/пДНК/GQDs (B). Обрезанная электрограмма агарозного геля (1%) анализа замедления рДНК (C). ζ-потенциал пептида MPG-2H1, GQDs и комплекса MPG-2H1/pDNA/GQDs 3 (D), полосы ошибок обозначают стандартное отклонение.
Исследование образования комплекса GQDs/MPG-2H1 пептид/пДНК

Предварительное исследование образования комплексов было проведено с помощью анализа замедления геля (рис. 4B и C). Замедление геля на основе акриламида показало, что двойные и тройные стабильные комплексы, включающие MPG-2H1 пептид/пДНК и MPG-2H1пептид/пДНК/GQDs, были успешно сформированы, исходя из значений, представленных в таблице 1. Как показано на рис. 4B, свободные пептиды MPG-2H1 проходят большее расстояние в геле по сравнению со смесью MPG-2H1/пДНК, тогда как комплексы MPG-2H1/пДНК/GQDs проходят в обратном направлении.

Мы также провели анализ замедления геля на основе агарозы с последующим окрашиванием бромистым этидием для подтверждения присоединения пДНК к комплексам (рис. 4C и S1), и результаты показали, что подвижность пДНК уменьшилась при конъюгировании с пептидом. Полоса пДНК оставалась в лунке из-за нейтрализации заряда комплекса MPG-2H1/пДНК.

Положительно заряженный пептид MPG-2H1 позволяет эффективно присоединять отрицательно заряженную пДНК, однако при декорировании этого комплекса GQDs полоса пДНК не наблюдалась на агарозном геле из-за возможного тушения бромистого этидия GQDs. Средний ζ-потенциал пептида MPG-2H1, свободных GQDs и комплекса пептид MPG-2H1/пДНК/GQDs составил +6,85, -36,87 мв и -2,56 мв, соответственно (рис. 4D). Изменение ζ-потенциала комплекса свидетельствует об установлении электростатических взаимодействий.

Морфология и распределение по размерам как GQDs, так и комплексов были определены с помощью ТЭМ. Результаты показывают, что средний размер комплексов MPG-2H1/pDNA составляет около 200 нм (рис. 5A). Средний диаметр GQDs составляет около 80 нм (рис. 5B), а средний размер полученных комплексов MPG-2H1/pDNA/GQDs находится в пределах 135-280 нм (рис. 5C). Синтезированные GQDs имели стопообразную структуру, где они представляли собой небольшие круглые слои, расположенные на большем более тонком слое, как было показано ранее для GQDs. 7,39

Рисунок 5: ТЭМ изображение негативно окрашенного целевого комплекса MPG-2H1/pDNA7 (A) GQDs (B) и комплекса MPG-2H1/pDNA/GQDs (C).

Исследование ФЛ свойств комплексов MPG-2H1/pDNA/GQDs по сравнению со свободными GQDs показало, что присоединение комплекса MPG-2H1/pDNA к GQDs не оказывает существенного влияния на интенсивность ФЛ GQDs (рис. 6). Кроме того, стабильность флуоресценции свободных GQDs и комплексов была оценена через 24 ч, 48 ч и 72 ч. Результаты показали, что также нет существенной разницы между интенсивностью их флуоресценции, и через каждые 24 ч наблюдается лишь незначительное снижение интенсивности флуоресценции как GQDs, так и комплексов (рис. 7).

Рисунок 6: Эмиссионный спектр GQDs, комплекс 1, 2 и 3 (возбуждение при 400 нм).
Рисунок 7: Анализ стабильности GQDs и комплексов в различные временные интервалы (24, 48 и 72 ч).
Оценка токсичности наночастиц

Цитотоксичность различных концентраций пептидов MPG-2H1 и синтезированных GQDs через 48 ч была исследована с помощью МТТ-теста. Результаты показали, что оцененные концентрации GQDs не показали значительной цитотоксичности в Т-клетках HEK 293 через 48 ч (до 400 нМ), также как и химерный пептид MPG-2H1 до концентрации 27,6 мкг (рис. 8). Аналогично нашим результатам несколько исследований подтвердили нецитотоксичность графеновых квантовых точек. 40,41,42,43

Рисунок 8: Анализ жизнеспособности клеток с GQDs (A) и пептидами (B) в течение 48 ч. В показаны контрольные клетки, инкубированные в среде клеточной культуры без GQDs или пептидов.
Визуализация клеточного поглощения

Для определения качественного поглощения комплексов Т-клетки HEK 293 подвергались воздействию GQDs и комплексов в различных концентрациях пептида MPG-2H1, пДНК и GQDs, а затем анализировались с помощью многорежимной системы детекции CytationTM 3 (рис. 9). Контрольные клетки не проявляли флуоресценции (рис. 9D), и только небольшая часть свободных GQDs проникла в клетки (рис. 9C). Однако комплексы смогли проникнуть в клетки (рис. 9A и B). Для обнаружения свободных и конъюгированных GQD были использованы две различные длины волн [(ex:469, em:525) и (ex:585, em:647)] (левое верхнее и правое верхнее изображения, соответственно, в каждой из четырех частей рис. 9). Комплекс 3 показал наибольшую интернализацию в клетки, а на следующем более низком уровне находились комплекс 2 (данные не показаны) и комплекс 1, соответственно (рис. 9A и B).

Рисунок 9: Изображения флуоресцентной микроскопии трансфицированных клеток с комплексом 1 (A), комплексом 3 (B), GQDs (C) и контрольных клеток (D) показаны на 4 различных панелях. На каждой панели: слева вверху возбуждение 469 нм и обнаружение длины волны эмиссии 525, справа вверху возбуждение 585 нм и обнаружение длины волны эмиссии 647, слева внизу показано светлое поле, а справа внизу указано наложение.

Интересно, что клетки, трансфецированные комплексами, демонстрировали значительную как зеленую, так и красную флуоресценцию. Эти результаты подтвердили уже полученные результаты, основанные на существовании двух популяций GQDs, полученных в результате нашей процедуры синтеза.

В целом, результаты показали, что свободные GQDs не могут значительно проникнуть в клетки, а нековалентная ассоциация с пептидом MPG-2H1 может увеличить скорость и эффективность поглощения GQDs в живые клетки. Согласно нашим результатам, через 6 ч комплексы начали проникать в клетки и увеличивались через 12 ч (данные не показаны), достигая максимума через 24 ч. К настоящему времени GQDs были успешно использованы для отслеживания клеток карциномы молочной железы (T47D), нейрональных стволовых клеток (NScs), поликлональных плазмобластных клеток (PPCs) и кардиогенных прогениторных клеток (CPCs) в течение 24 ч. 43

В исследовании, проведенном Zhang et al., результаты, полученные на основе изображений конфокальной флуоресцентной микроскопии, показали, что GQDs проникали в цитоплазму, но имели относительно слабый PL в ядре. Однако в нашем исследовании свободные GQDs не смогли проникнуть в клетки, что, вероятно, связано с высоким отрицательным зарядом на их поверхности. Кроме того, в другом исследовании Су и др. разработали пептидные нановолокна, украшенные GQDs с помощью нековалентных взаимодействий, для визуализации опухолевых клеток. Подобно нашим результатам, их конструкции легко проникали в живые клетки, однако свободные GQDs не показали значительного проникновения в клетки. 43,44

Результаты, полученные с помощью конфокальной микроскопии, подтвердили предыдущие результаты визуализации и выявили значительную разницу между клетками, трансфицированными свободными GQDs, и клетками, трансфицированными комплексом (рис. 10). Интересно, что GQDs, излучающие зеленый свет, в комплексе с MPG-2H1/пДНК обходили комплекс ядерной поры через NLS-мотив MPG-2H1, направляя пДНК в ядро. Однако только небольшая часть красных GQD смогла покинуть ядерную мембрану, вероятно, из-за их большего размера, и большинство из них было задержано вокруг ядра.

Можно сделать вывод, что зеленые GQD, прикрепленные к MPG-2H1-psiCHECK, могут войти в ядро, в то время как более крупные красные GQD не могут войти в ядро так же хорошо, как зеленые. Вероятно, при делении клетки большее количество красных флуоресцентных GQD может попасть в ядро дочерних клеток. В данном исследовании GQDs и химерный пептид NLS (MPG-2H1) были присоединены с помощью простых нековалентных взаимодействий, однако в недавнем докладе Maity et al. показали ковалентное присоединение ядро-оболочечных CdSe-ZnS QDs с пептидом NLS (PKKKRKVKAA) с помощью подхода, содержащего три утомительных и трудоемких этапа декорирования. 45

Рисунок 10: Конфокальная микроскопия изображений трансфицированных клеток с комплексом 3 (A) и GQDs (B). Синим цветом показано нуклеиновое пятно DAPI, зеленым и красным - GQDs. Четыре изображения каждой части: возбуждение при 408 нм для выявления нуклеинового пятна DAPI (слева вверху), возбуждение при 457 нм для выявления зеленых GQDs (справа вверху), возбуждение при 642 нм для выявления красных GQDs (слева внизу) и наложение (справа внизу).
Трансфекция клеток

Согласно результатам, полученным при замедлении геля, анализах цитотоксичности и биовизуализации, были получены наилучшие соотношения GQDs, пептида и пДНК (Таблица 1). Активность люциферазы измеряли, как уже описано выше. Филиал PEI (25 кД) с соотношением N/P 8 использовался для проверки эффективности трансфекции комплексов. Самая высокая эффективность трансфекции была получена для комплекса 3, состоящего из 1,0 мкг пДНК, 24,3 мкг пептида MPG-2H1 и 1,6 × 10-1 нмоль GQDs. Следует отметить, что при увеличении количества GQDs до 1,6 × 10-1 нмоль при постоянных значениях 24,3 мкг пептида MPG-2H1 и 1,0 мкг пДНК (соотношение N/P = 18) эффективность трансфекции увеличивалась. Однако дальнейшее увеличение концентрации GQDs или пептидов (комплекс 4 и комплекс 5), приводило к снижению эффективности трансфекции (рис. 11). Таким образом, все три компонента наших конструкций были конъюгированы в оптимальных пропорциях в комплексе 3. Интересно, что комплекс 3 показал 5-кратное увеличение эффективности трансфекции по сравнению с комплексом пептид/пДНК MPG-2H1 (рис. 11).

Рисунок 11: Трансфекция плазмиды psiCHEK, содержащей ген люциферазы, с помощью различных комплексов MPG-2H1/пДНК/ГКД и MPG-2H1 пептид/пДНК. Активность люциферазы является показателем эффективности трансфекции.

Неожиданно полученные результаты показали, что хлорохин, как лизосомотропный агент, снижал эффективность трансфекции комплексов MPG-2H1/pDNA/GQDs, напротив, способствовал трансфекции комплексов MPG-2H1/pDNA (рис. 12). На основании особых химических структур хлорохина и наночастиц GQDs можно сделать вывод, что он вмешивается в π-π стэкинг и электростатические взаимодействия между ароматическими кольцами и их функциональными группами, соответственно. Таким образом, комплексы могут стать нестабильными, а хлорохин конкурирует с пептидом MPG-2H1 за взаимодействие с рДНК и, следовательно, снижает экспрессию генов. 46,47,48

Рисунок 12: Влияние хлорохина на эффективность трансфекции плазмиды psiCHEK, содержащей ген люциферазы, с использованием различных комплексов MPG-2H1/пДНК/GQDs и MPG-2H1 пептид/пДНК. Активность люциферазы является показателем эффективности трансфекции.
Флуориметрический анализ

Флуориметрические данные подтвердили предыдущие результаты, поскольку клетки, трансфецированные комплексом 3, показали самый высокий сигнал флуоресценции, тогда как клетки, трансфецированные комплексом 2, комплексом 1, комплексом 4 и комплексом 5, расположились соответственно в нижних рядах. Клетки, трансфецированные GQDs, не показали существенных различий с клетками, трансфецированными комплексом MPG-2H1/пДНК или нетрансфецированными контрольными клетками. Типичные данные и выбранные лунки показаны на рис. 13, а также средняя флуоресценция каждой лунки была построена в виде точечной диаграммы.

Рисунок 13: Флуориметрический анализ трансфицированных клеток с комплексами 1-5, GQDs, комплексом MPG-2H1/pDNA и контрольных клеток с использованием режима сканирующей области.

Результаты, полученные при биоимиджинге, трансфекции клеток и флуориметрических анализах, показывают, что использование определенных соотношений GQDs и MPG-2H1/pDNA, комплексов может сделать наиболее подходящие наноносители с двойной способностью отслеживания и доставки гена в живые клетки и преодоления клеточного трафика, эффективно.

В данном исследовании нам впервые удалось одновременно осуществить ядерное нацеливание и отслеживание генов с помощью простых нековалентных взаимодействий между GQDs и химерными комплексами пептид/пДНК.

Выводы

В заключение, согласно результатам, представленным в данной рукописи, можно сделать вывод, что был разработан новый подход для одновременной доставки пДНК и GQDs с двумя различными зелеными и красными излучениями посредством нековалентного присоединения к химерному пептиду, обладающему способностью упаковки ДНК, выхода из эндосомы и клеточного ядерного таргетинга. GQDs могут обеспечить эффективное отслеживание и усилить интернализацию плазмиды, содержащей ген люциферазы светлячка, в Т-клетки HEK 293. Разработанный нами наноноситель может рассматриваться как перспективный вектор для усиленной ядерной интернализации и отслеживания пДНК in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Реагенты

E. coli C41 (DE3) pLysS был получен от Novagen. Вектор экспрессии pET28a был приобретен от Invitrogen. Фетальная бычья сыворотка (FBS) и модифицированная орлиная среда Дульбекко F12 (DMEM F12) были приобретены у Gibco, набор для выделения плазмид и колонка Ni-NTA-сефарозы - у Qiagen. ИПТГ получен от компании Vivantis. Люциферин был приобретен у Resem (Нидерланды). Аденозинтрифосфат (АТФ) и диализный мешок (2,5 KDa) были приобретены у компании Sigma. MTT 3-(4,5-s-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид был получен от Sigma-Aldrich. Графитовый порошок (меш~200 мкм), KMnO4, NaNO3, H2O2, диметилформамид (DMF) были приобретены в Chemlab. Серная кислота (98%) была получена от Merck.

Экспрессия и очистка химерного пептида MPG-2H1

Для экспрессии разработанного химерного пептида сначала вектор экспрессии (pET28a) трансформировали в E. coli C41 (DE3) pLysS. Затем 10 мл среды LB, содержащей 50 мМ канамицина, инкубировали со свежей колонией бактерий, несущей экспрессионную плазмиду, и выращивали при 37 °C в течение ночи при встряхивании со скоростью 200 об/мин. 1 мл предварительно культивированных бактерий использовали для инокуляции 250 мл среды 2xyt и выращивали при 37 °C при энергичном встряхивании до достижения OD600 0,4. Смесь индуцировали ИПТГ до конечной концентрации 0,2 мМ и инкубировали при 37 °C в течение 4 ч при встряхивании со скоростью 200 об/мин. Клетки собирали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин при 4 °C.

Клеточные гранулы ресуспендировали в буфере для лизиса [20 мМ Tris-Base, 500 мМ NaCl, 8 М мочевины, 5 мМ имидазола (pH = 11)] и инкубировали при 20 °C в течение 1 ч со встряхиванием при 200 об/мин. Центрифугирование проводили дважды при 6000 и 12000 об/мин при 4 °C в течение 20 мин для осаждения нерастворимых фракций. Затем супернатант загружали на колонку Ni-NTA-сефарозы и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем колонку промывали восемью промывочными буферами с возрастающей концентрацией имидазола и уменьшающейся концентрацией мочевины [20 мМ Tris-Base, 1,0 М NaCl, 7,0 М, 6,0 М, 4,0 М, 2,0 М и 0 М мочевины, 20 мМ, 40 мМ, 60 мМ и 70 мМ имидазола, (pH = 8)]. Градиент мочевины применялся для постепенного удаления мочевины и последующего медленного рефолдинга пептида MPG-2H1. Нужный пептид вымывался из колонки элюирующим буфером [20 мМ Tris-Base, 500 мМ NaCl и 250 мМ имидазола; (pH = 8)]. После наблюдения полос пептида на гель-электрофорезе додецилсульфат-полиакриламида натрия 15% (SDS-PAGE), очищенный пептид обессоливали диализом (отсечка: 2,5 KD) против буфера PBS, pH = 7,4 при 4 °C в течение 48 ч. Диализный буфер меняли каждые 6 ч. Наконец, пептид накапливали и хранили при -20 °C для последующих этапов.

Синтез оксида графена

Оксид графена был синтезирован с использованием модифицированного метода Хаммера, как сообщалось ранее. Порошок графита [0,5 г (≤20 мкм, Fluka)] диспергировали в 23 мл серной кислоты при 0 °C. Затем в смесь добавляли 0,5 г NaNO3 и 3 г KMnO4 и раствор перемешивали 3 часа. Затем в смесь добавили 0,5 г NaNO3 и 3 г KMnO4 и раствор перемешивали в течение 3 ч при 35 °C. В конце добавили 40 мл деионизированной (DI) воды и затем добавили раствор 100 мл DI воды и 3 мл H2O2 (30%).

Суспензию оксида графита желтого цвета фильтровали и промывали HCl и водой для удаления лишних ионов (при объемном соотношении 1:10 для HCl и DI воды). Процесс промывки водой DI повторяли несколько раз, чтобы сбалансировать pH около 5, затем образцы подвергали звуковой обработке (100 кГц, 120 Вт) в течение 40 мин для эксафолиации листов оксида графена. суспензию центрифугировали (3500 об/мин, 30 мин) для удаления неэксафолиации листов оксида графита. 49,50,51,52

Подготовка GQDs

GO (270 мг) растворили в ДМФ (20 мл) и раствор подвергли сонированию в течение 30 мин (120 Вт, 100 кГц). Затем смесь GO/DMF переносили в автоклав (30 мл) с поли(тетрафторэтиленовым) (тефлоновым) покрытием и нагревали при 200 °C в течение 5 ч. После завершения реакции реакторы охлаждали до комнатной температуры. Продукты реакции, включающие желто-коричневый супернатант и черный осадок, дважды фильтровали и собирали желто-коричневую суспензию. Наконец, полученные GQDs были высушены с помощью роторного испарителя, а затем растворены в воде.

Определение концентрации GQDs

Чтобы определить концентрацию GQDs, мы измерили спектры поглощения с помощью спектрофотометра UV-Vis (PerkinElmer, Lambda 25). Затем, согласно уравнению Бира-Ламберта, максимуму поглощения при 320 нм и коэффициенту молярной экстинкции GQDs (~106 M-1 см-1), определяли концентрацию GQDs. 53

Конъюгация MPG-2H1, пДНК и GQDs

Сначала 1,0 мкг плазмиды psi-CHEK, несущей ген люциферазы светлячка, смешивали с различными количествами очищенного пептида в соотношении азота и фосфата (N/P) = 18 и инкубировали при комнатной температуре в течение 40 мин. Затем различные концентрации GQDs (180, 240, 400, 600 нМ) из 800 нМ исходного раствора смешивали с подготовленными комплексами pDNA/MPG-2H1. Этот этап проводился на льду. Затем эти смеси инкубировали при 4 °C при контролируемом перемешивании в течение ночи.

Анализ на замедление гелеобразования

Нативные акриламидные и 1% агарозные гели были использованы для исследования электрофоретической подвижности пептида, плазмиды и комплексов pDNA/MPG-2H1 (0,1 мкг pDNA и 2.43 мкг MPG-2H1) и pDNA/MPG-2H1/GQDs (0,1 мкг pDNA, 2,43 мкг MPG-2H1 и 1,6 × 10-2 нмоль GQDs) с последующим окрашиванием трипановым синим и визуализацией УФ-освещением, соответственно.

Характеристика GQDs

UV-Vis спектр синтезированных GQDs измеряли на спектрофотометре UV-Visible (PerkinElmer, Lambda 25). Спектры флуоресценции регистрировали с помощью многорежимной системы детектирования CytationTM 3 (BioTek) при комнатной температуре. Рамановский и ИК-Фурье спектры как два дополнительных спектроскопических метода регистрировали с помощью дисперсионного рамановского спектрометра Almega Thermo Nicolet (возбуждающий лазер 532 нм) и ИК-Фурье спектрометра Tensor 27 (с использованием метода гранул KBr), соответственно. Для определения размера и высоты пленки GQDs были приготовлены методом капельного литья разбавленной суспензии и помещены на поверхность очищенного SiO2/Si(100), а АСМ изображения были получены с помощью прибора атомно-силовой микроскопии (АСМ) (Digital Instruments, NanoScope V).

ТЭМ изображения GQDs и приготовленного комплекса были получены на кружевной углеродной пленке на медной сетке с помощью ТЭМ, Zeiss-EM10C-80 KV. СЭМ изображения получены с помощью растрового электронного микроскопа модели Philips XL30. ζ-потенциал GQDs и приготовленных комплексов определяли методом динамического рассеяния света. Для измерения ζ-потенциала при 4 °C использовали прибор Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания). Для определения стабильности GQDs интенсивность PL свободных GQDs и GQDs в сочетании с комплексами MPG-2H1/pDNA исследовали с помощью многорежимной системы детектирования CytationTM 3 через 24 ч, 48 ч и 72 ч.

Культура клеток

Линию клеток HEK 293T культивировали в среде DMEM F12, дополненной стрептомицином (100 мг/мл) и пенициллином (100 Ед/мл) в увлажненной атмосфере 5% CO2 при 37 °C. Трипсин (0,25%) использовали для переваривания клеток в течение 2 мин, после 2 дней и включения пассажа.

Анализ на цитотоксичность

Для определения цитотоксичности GQDs и химерного пептида MPG-2H1 использовали реактив метилтиазолилдифенилтетразолия (МТТ). Т-клетки НЕК 293 в фазе экспоненциального роста высевали в 96-луночные планшеты (2 × 104 клеток на лунку) и различные концентрации химерного пептида (4,6, 6,9, 9,2, 11,5, 13,8, 18,4 и 27,6 мкг) и GQDs (20, 40, 80, 160, 240, 320 и 400 нМ) культивировали с клетками и инкубировали в течение 48 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой CO2 5%. В каждую лунку добавляли по 10 мкл солевого раствора МТТ (5 мг/мл) и далее инкубировали в течение 4 ч. Кристаллы формазана, образованные жизнеспособными клетками, растворяли в ДМСО (100 мкл), и планшеты считывали в микропланшетном ридере (ELx800, Biotek, США) при 570 нм.

Клеточная биоимиджинг

Для визуализации проникновения биосовместимых флуоресцентных нанокомплексов в живые клетки использовался метод флуоресцентной микроскопии. Для этого клетки HEK 293T были посеяны в культуральные планшеты и инкубированы при 37 °C. Комплексы, состоящие из GQDs, пептида MPG-2H1 и пДНК, были приготовлены с различными концентрациями, как указано в таблице 1 и инкубировали при 4 °C в течение ночи. Затем каждую из них разбавляли свободной сывороткой клеточной культуральной среды до общего объема 300 мкл в каждой лунке. 54

После инкубации в течение 24 ч в каждую лунку добавляли свежую среду с 10% FBS и еще через 24 ч клетки трижды промывали фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) и, наконец, проводили визуализацию флуоресценции при двух различных длинах волн ((ex:469 нм, em:525 нм) и (ex:585 нм, em:647 нм)) с помощью многорежимной системы обнаружения CytationTM 3, и для дальнейшего исследования клеточные ядра были идентифицированы с помощью окрашивания DAPI (ex:405 нм, em:425-475 нм), а проникновение комплексов в ядро клеток было проведено с помощью конфокальной микроскопии.

Анализ на трансфекцию

Т-клетки HEK 293 в фазе экспоненциального роста были посеяны в 24-луночные планшеты с плотностью 1 × 105 на каждую лунку. Во время трансфекции клетки были 80% конфлюентными. За два часа до трансфекции проводили сывороточное голодание. Затем вводили различные соотношения уже приготовленных комплексов GQDs/MPG-2H1 пептид/пДНК (табл. 1) были добавлены в каждую лунку. Через 24 ч среду с клетками не удаляли и дополняли ее FBS до тех пор, пока среда каждой лунки не достигала 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и инкубировали еще 24 ч в увлажненной атмосфере 5% CO2 и 37 °C.

В качестве положительного контроля использовался PEI. Люцифераза светлячка в плазмиде Psi-CHEK использовалась в качестве репортерного гена, который позволяет быстро и количественно оценить результаты. Для анализа активности люциферазы трансфицированные клетки в каждой лунке дважды осторожно промывали PBS и лизировали с помощью 50 мкл буфера CCLR (Cell Culture Lysis Reagent). Активность люциферазы регистрировали (RLU/сек) в каждой лунке в присутствии люциферина, АТФ и Mg2+ в качестве субстратов люциферазы светлячков с помощью люминометра (Berthold detection systems, GmbH).

Кроме того, трансфекцию проводили в присутствии 100 мкМ хлорохина при добавлении в клеточную среду для исследования способности наших комплексов к эндосомальному скапированию.

Флуориметрический анализ

Для дальнейшей оценки трансфекции флуоресцентных наноструктур в нужные клетки был проведен флуориметрический анализ как быстрый, не дорогой и достаточно чувствительный метод.. Для этого клетки HEK 293T в фазе экспоненциального роста высевали при плотности 7 × 104 на каждую лунку черного 96-луночного планшета для клеточных культур (SPL Life Sciences). Трансфекцию проводили точно так же, как описано ранее. Перед визуализацией с помощью флуоресцентного микроскопа каждую лунку трижды медленно промывали PBS. Для оценки попадания нанокомплексов в клетки был выбран режим сканирования области, определенный в программном обеспечении Gen5™ многорежимной системы детекции CytationTM 3 компании BioTek. 55

Ссылки

1. Гримм, Д. и Кей, М. А. РНКи и генная терапия: взаимное притяжение. Американское общество гематологии 1, 473-481 (2007).

Статья Google Scholar

2. Андерсон, В. Ф. Генная терапия человека: научные и этические соображения. Журнал медицины и философии 10, 275-292 (1985).

CAS Статья PubMed Google Scholar

3. Delstein, M. L., Abedi, M. R., Wixon, J. & Edelstein, R. M. Gene therapy clinical trials worldwide 1989-2004-an overview. Журнал генной медицины 6, 597-602 (2004).

Статья Google Scholar

4. Ren, J. et al. Неинвазивное отслеживание транскрипта генов и нейропротекции после генной терапии. Генная терапия 23, 1-9 (2016).

Статья PubMed Google Scholar

5. Массадех, С. и др. Наноматериалы для генной терапии: Эффективный способ преодоления проблем, связанных с доставкой генов. Журнал биосенсоров и биоэлектроники 7, 1-12 (2016).

Статья Google Scholar

6. Чира С. и др. Прогресс в создании безопасных и эффективных векторов генной терапии. Oncotarget 6, 30675-30703 (2015).

Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

7. Majidi, A., Nikkhah, M., Sadeghian, F. & Hosseinkhani, S. Development of novel recombinant biomimetic chimeric MPG-based peptide as nanocarriers for gene delivery: imitation of a real cargo. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 107, 191-204 (2016).

CAS Статья PubMed Google Scholar

8. Majidi, A., Nikkhah, M., Sadeghian, F. & Hosseinkhani, S. Design and bioinformatics analysis of novel biomimetic peptides as nano carriers for gene transfer. Журнал Наномедицина 2, 29-38 (2015).

CAS Google Scholar

9. Cheraghi, R., Alipour, M., Nazari, M. & Hosseinkhani, S. Оптимизация условий для системы доставки генов на основе PEI. Журнал Наномедицина 4, 8-16 (2017).

Google Scholar

10. Cheraghi, R., Nazari, M., Alipour, M., Majidi, A. & Hosseinkhani, S. Разработка целевого анти-HER2 scFv химерного пептида для доставки генов в HER2-положительные клетки рака молочной железы. Международный журнал фармацевтики 515, 632-643 (2016).

CAS Статья PubMed Google Scholar

11. Li, S. D. & Huang, L. Прогресс и перспективы генной терапии: невирусная генная терапия путем системной доставки. Генная терапия 13, 1313-1319 (2006).

CAS Статья PubMed Google Scholar

12. Sadeghian, F., Hosseinkhani, S., Alizadeh, A. & Hatefi, A. Дизайн, проектирование и подготовка многодоменного слитого вектора для доставки генов. Международный журнал фармацевтики 427, 393-399 (2012).

CAS Статья PubMed Google Scholar

13. Саху, Х. Методы флуоресцентного мечения биомолекул: воспоминания. RSC Advances 2, 7017-7029 (2012).

CAS Статья Google Scholar

14. Jung., D., Min, K., Jung, J., Jang, W. & Kwon, Y. Подходы на основе химической биологии к флуоресцентному мечению белков в живых клетках. Molecular BioSystems 9, 862-872 (2013).

CAS Статья PubMed Google Scholar

15. Маркс, К. М. и Нолан, Г. П. Стратегии химической маркировки для клеточной биологии. Nature Methods 3, 591-596 (2006).

CAS Статья PubMed Google Scholar

16. Сандерсон, М. Дж., Смит, И., Паркер, И. и Бутман, М. Д. Флуоресцентная микроскопия. Cold Spring Harbor Protocols 10, 1042-1065 (2014).

Google Scholar

17. Мейеринг, Е., Смаль, И. и Данузер, Г. Отслеживание в молекулярной биовизуализации. IEEE. Signal. Processing Magazine 23, 46-53 (2006).

ADS Статья Google Scholar

18. Реш-Генгер, У., Граболле, М., Кавальер-Жарико, С., Ничке, Р. и Нанн, Т. Квантовые точки против органических красителей в качестве флуоресцентных меток. Nature Methods. 5, 763-775 (2008).

CAS Статья PubMed Google Scholar

19. Дженесене, К. Использование флуоресцентных зондов: их влияние на клеточную биологию и ограничения. Anatomical Record 295, 2031-2036 (2012).

Статья Google Scholar

20. Srinivasan, C. et al. Маркировка и внутриклеточное отслеживание функционально активной плазмидной ДНК с помощью полупроводниковых квантовых точек. Молекулярная терапия 14, 192-201 (2006).

CAS Статья PubMed Google Scholar

21. Derfus, A. M., Chen, A. A., Min, D. H., Ruoslahti, E. & Bhatia, S. N. Targeted quantum dot conjugates for siRNA delivery. Химия биоконъюгатов 18, 1391-1396 (2007).

CAS Статья PubMed Google Scholar

22. Michalet, X. et al. Квантовые точки для живых клеток, визуализации in vivo и диагностики. Science 307, 538-544 (2005).

ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

23. Jaiswal, J. K. & Simon, S. M. Potentials and pitfalls of fluorescent quantum dots for biological imaging. Trends in Cell Biology 14, 497-504 (2004).

CAS Статья PubMed Google Scholar

24. Чанг, Й. П., Пино, Ф., Антельман, Дж. и Вайс, С. Отслеживание биомолекул в живых клетках с помощью квантовых точек. Journal of Biophotonics 1, 287-298 (2008).

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

25. Schroeder, K. L., Goreham, R. V. & Nann, T. Graphene quantum dots for theranostics and bioimaging. Pharmaceutical Research 33, 2337-2357 (2016).

CAS Статья PubMed Google Scholar

26. Shen, J., Zhu, Y., Yang, X. & Li, C. Graphene quantum dots: emergent nanolights for bioimaging, sensors, catalysis and photovoltaic devices. Chemical Communications 48, 3686-3699 (2012).

CAS Статья PubMed Google Scholar

27. Pan, D., Zhang, J., Li, Z. & Wu, M. Гидротермальный маршрут для резки графеновых листов в сине-люминесцентные графеновые квантовые точки. Advanced Materials 22, 734-738 (2010).

Статья PubMed Google Scholar

28. Гейм, А. К. и Новоселов, К. С. Возникновение графена. Nature Materials 6, 183-191 (2007).

ADS CAS Статья PubMed Google Scholar

29. Rao, C. N., Sood, A. K., Subrahmanyam, K. S. & Govindaraj, A. Graphene: the new two-dimensional nanomaterial. Angewandte Chemie International Edition 48, 7752-7777 (2009).

CAS Статья PubMed Google Scholar

30. Soldano, C., Mahmood, A. & Dujardin, E. Производство, свойства и потенциал графена. Углерод 48, 2127-2150 (2010).

CAS Статья Google Scholar

31. Tetsuka, H. et al. Оптически перестраиваемые аминофункционализированные графеновые квантовые точки. Advanced Materials 24, 5333-5338 (2012).

CAS Статья PubMed Google Scholar

32. Nigam, P. et al. Графеновые квантовые точки, конъюгированные с наночастицами альбумина, для целевой доставки лекарств и визуализации рака поджелудочной железы. Журнал химии материалов B 2, 3190-3195 (2014).

CAS Статья Google Scholar

33. Lin, L. et al. Люминесцентные графеновые квантовые точки как новые флуоресцентные материалы для экологических и биологических приложений. Trends in Analytical Chemistry 54, 83-102 (2014).

CAS Статья Google Scholar

34. Li, L. et al. Фокусировка на люминесцентных графеновых квантовых точках: текущее состояние и будущие перспективы. Nanoscale. 5, 4015-4039 (2013).

ADS CAS Статья PubMed Google Scholar

35. Chua, C. K. et al. Синтез сильно флуоресцирующих графеновых квантовых точек путем раскрытия клетки бакминстерфуллерена. ACS. Nano. 9, 2548-2555 (2015).

CAS Статья PubMed Google Scholar

36. Gan, Z., Xu, H. & Hao, Y. Механизм фотолюминесценции графеновых квантовых точек и других производных оксида графена, зависящей от возбуждения: консенсус, споры и проблемы. Nanoscale. 8, 7794-7807 (2016).

ADS CAS Статья PubMed Google Scholar

37. Roy, P., Chen, P. C., Periasamy, A. P., Chen, Y. N. & Chang, H. T. Photoluminescent carbon nanodots: synthesis, physicochemical properties and analytical applications. Materials Today 18, 447-458 (2015).

CAS Статья Google Scholar

38. Lin, L. & Zhang, S. Создание высокопроизводительных водорастворимых люминесцентных графеновых квантовых точек путем отшелушивания и дезинтеграции углеродных нанотрубок и графитовых хлопьев. Chemical Communications 48, 10177-10179 (2012).

CAS Статья PubMed Google Scholar

39. Ye, R. et al. Уголь как богатый источник графеновых квантовых точек. Природа. Communications 4, 2943-2949 (2013).

Google Scholar

40. Чонг, Й. и др. Токсичность графеновых квантовых точек in vitro и in vivo. Biomaterials. 35, 5041-5048 (2014).

CAS Статья PubMed Google Scholar

41. Wang, S., Cole, I. S. & Qin, L. The toxicity of graphene quantum dots. RSC Advances 6, 89867-89878 (2016).

CAS Статья Google Scholar

42. Wang, X. et al. Многофункциональные графеновые квантовые точки для одновременной целевой клеточной визуализации и доставки лекарств. Colloids and Surfaces B 122, 638-644 (2014).

CAS Статья Google Scholar

43. Zhang, M. et al. Легкий синтез водорастворимых, высокофлуоресцентных графеновых квантовых точек в качестве надежной биологической метки для стволовых клеток. Журнал химии материалов 22, 7461-7467 (2012).

CAS Статья Google Scholar

44. Su, Z. et al. Мотив-дизайн пептидных нановолокон, украшенных графеновыми квантовыми точками, для одновременного нацеливания и визуализации опухолевых клеток. Advanced Functional Materials 25, 5472-5478 (2015).

CAS Статья Google Scholar

45. Maity, A. R. & Stepensky, D. Эффективное субклеточное нацеливание на ядро клетки квантовых точек, плотно украшенных пептидом последовательности ядерной локализации. ACS Applied Materials &. Interfaces 8, 2001-2009 (2016).

CAS Google Scholar

46. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M. & Midoux, P. Предположительная роль хлорохина в переносе генов в клеточную линию гепатомы человека с помощью комплексов ДНК/лактозилированный полилизин. Экспериментальное исследование клеток 225, 186-194 (1996).

CAS Статья PubMed Google Scholar

47. Abrantes, P., Lopes, L. F., do. Rosário, V. E. & Silveira, H. Effect of chloroquine on the expression of genes involved in the mosquito immune response to Plasmodium infection. биохимия насекомых и молекулярная биология насекомых. 35, 1124-1132 (2005).

CAS Статья Google Scholar

48. Паркер, Ф. С. и Ирвин, Дж. Л. Взаимодействие хлорохина с нуклеиновыми кислотами и нуклеопротеинами. Журнал биологической химии 199, 897-909 (1952).

CAS PubMed Google Scholar

49. Уильям, С. Хаммерс, мл. и Ричард, Е. Оффеман. Подготовка графитового оксида. Журнал Американского химического общества 80, 1339-1339 (1958).

Статья Google Scholar

50. Akhavan, O., Ghaderi, E., Abouei, E., Hatamie, S. & Ghasemi, E. Accelerated differentiation of neural stem cells into neurons on ginseng-reduced graphene oxide sheets. Carbon 66, 395-406 (2014).

CAS Статья Google Scholar

51. Hatamie, S. et al. Листы оксида графена, восстановленные куркумином, и их воздействие на клетки рака молочной железы человека. Materials Science and Engineering C: Materials for Biological Applications 55, 482-489 (2015).

CAS Статья PubMed Google Scholar

52. Mahmoudifard, M. et al. Различная судьба клеток-сателлитов на проводящих композитных электроспущенных нановолокнах с графеном и нанолистами оксида графена. Биомедицинские материалы 11, 025006-025017 (2016).

ADS Статья PubMed Google Scholar

53. Wang, L. et al. Граммасштабный синтез монокристаллических графеновых квантовых точек с превосходными оптическими свойствами. Nature Communications 5, 5357-5366 (2014).

CAS Статья PubMed Google Scholar

54. Drummen, G. P. C. Флуоресцентные зонды и методы флуоресценции (микроскопии) - освещение биологических и биомедицинских исследований. Молекулы 17, 14067-14090 (2012).

CAS Статья PubMed Google Scholar

55. Kovacs, A., Baranyai, M. & Wojnarvits, L. Применение флуориметрии для целей дозиметрии. Международное агентство по атомной энергии 2, 475-483 (1998).

Google Scholar