Quais são as conclusões do estudo de inalação a curto prazo das nano-placas de óxido de grafite?


Nano

Os óxidos de grafeno possuem propriedades físico-químicas únicas com importantes aplicações potenciais em eletrônica, produtos farmacêuticos e medicina.

Toxicidade inalatória do óxido de grafeno

Entretanto, a toxicidade após a exposição por inalação ao óxido de grafeno ainda não foi elucidada. Portanto, neste estudo, foi realizada uma análise a curto prazo da toxicidade por inalação do óxido de grafeno, utilizando um sistema de inalação apenas nasal e ratos Sprague-Dawley machos.

Um total de quatro grupos (15 ratos por grupo) foram expostos: (1) controle (ar fresco), (2) baixa concentração (0,76 ± 0,16 mg/m3), (3) concentração moderada (2,60 ± 0,19 mg/m3), e (4) alta concentração (9,78 ± 0,29 mg/m3). Os ratos foram expostos ao óxido de grafeno por 6 h/dia durante 5 dias, seguidos de períodos de recuperação de 1, 3, e 21 dias.

Não foram observadas mudanças significativas no peso do corpo ou dos órgãos após exposição a curto prazo ou durante o período de recuperação. Similarmente, não foram detectados efeitos sistêmicos significativos de significância toxicológica em ensaios hematológicos, marcadores inflamatórios em lavado broncoalveolar (BAL), citocinas em fluido BAL, ou ensaios bioquímicos de sangue após exposição ao óxido de grafeno ou durante o período de observação pós-exposição.

Além disso, não foram observadas diferenças significativas na diferenciação das células BAL, tais como linfócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares. Macrófagos alveolares carregados de óxido de grafite como uma resposta de depuração espontânea foram observados nos pulmões de todos os grupos de concentração de 1 dia a 21 dias após a exposição.

O exame histopatológico do fígado e dos rins não revelou lesões histopatológicas significativas relevantes para o produto em estudo. É importante ressaltar que, similar aos relatórios anteriores sobre a inalação de grafeno, apenas uma toxicidade mínima ou imperceptível do óxido de grafeno foi observada nos pulmões e outros órgãos neste estudo de inalação de curto prazo realizado apenas através do nariz.

Introdução

O grafeno é definido como uma camada única de átomos de carbono, com cada átomo conectado a três vizinhos em uma estrutura alveolar (ISO TS 80004-3, 2010). No caso do óxido de grafeno (GO), os grupos funcionais epóxidos (1,2 éter) e hidroxil estão covalentemente ligados em cada lado do plano basal, enquanto os grupos carboxil estão localizados nas bordas (Balapanuru et al., 2010).

Este nanomaterial forte e leve deve ser usado em muitos campos industriais, incluindo aplicações biomédicas, eletrônica, energia e sensores, mas isto também levanta preocupações sobre a exposição humana e os riscos ambientais e ocupacionais (Sanchez et al., 2012; Yang et al., 2015; Lee et al., 2016; Park et al., 2017).

A exposição ocupacional aos nanomateriais de grafeno pode ocorrer no ar durante a produção de nanomateriais de grafeno através de processos de oxidação e redução, e as formas expostas podem incluir nanoplaquetas de grafeno individuais, agregados ou aglomerados (Lee et al., 2016).

O óxido de grafeno (200-500 nm de tamanho lateral) foi previamente descoberto para induzir citotoxicidade e genotoxicidade nos fibroblastos pulmonares humanos de forma dose-dependente (1-100 μm/ml), com tensão oxidativa e carga superficial de óxido de grafeno mostrada para mediar a toxicidade (Wang et al., 2013).

A nível celular, o óxido de grafeno (160 - 780 nm) não penetrou nas células A549, mas causou estresse oxidativo de maneira dose-dependente e resultou em uma leve perda de viabilidade celular somente em altas concentrações, sugerindo que o óxido de grafeno é um material relativamente seguro (Chang et al., 2011).

Além disso, as injeções de óxido de grafeno nas veias traseiras de ratos por 7 dias em concentrações de 2,5, 5 e 10 mg/kg de peso corporal não causaram mudanças comportamentais em experimentos de campo e testes de bateria observacional funcional, mas causaram inflamação dos pulmões, fígado e baço em alta concentração (10 mg/kg). As injeções de óxido de grafite também diminuíram o colesterol, a lipoproteína de alta densidade (HDL) e os níveis de lipoproteína de baixa densidade (Li et al., 2016).

Outro estudo sobre a toxicidade aguda por inalação do óxido de grafeno também mostrou que a exposição aguda por inalação ao óxido de grafeno em concentrações de 0,46 e 3,76 mg/m3 induziu respostas tóxicas mínimas nos pulmões de ratos Sprague-Dawley masculinos sem aumentar os marcadores inflamatórios (Han et al., 2015).

Independentemente disso, a reatividade superficial, tamanho e estado de dispersão dos nanomateriais de grafeno desempenham papéis importantes na indução de toxicidade e biodistribuição dos nanomateriais de grafeno.

Além disso, o estresse oxidativo e a indução de resposta inflamatória também são importantes para a indução de toxicidade relacionada à biodistribuição de nanomateriais de grafeno (Ema et al., 2017).

Portanto, apesar de vários estudos sobre a toxicidade aguda por inalação do óxido de grafeno, não houve nenhum estudo sobre a toxicidade por inalação repetida do óxido de grafeno, que é mais relevante para avaliar os perigos da exposição repetida a nanomateriais de grafeno no local de trabalho.

Assim, este estudo coletou os dados necessários para uma avaliação de segurança do óxido de grafeno, incluindo toxicidade pulmonar, toxicidade sistêmica via hematologia, bioquímica do sangue e histopatologia nos principais órgãos após 5 dias de exposição e após vários períodos de pós-exposição.

Materiais e métodos

Caracterização do óxido de grafeno

A nanopóra de óxido de grafieno (GO-A200, IGH20160414; espessura 1~2 da camada atômica) utilizada nos experimentos foi fornecida pela Grapheneall Co. (Gwinsean-gu, Suwon-si, Gyeonggi-do, Coréia do Sul). As propriedades físico-químicas da nanopóra de óxido de grafieno foram caracterizadas, incluindo seu conteúdo elementar, tamanho lateral, espessura, relação D/G, cristalinidade e condutividade.

O conteúdo elementar foi determinado pela análise termogravimétrica (TG/DTA 7300, Seiko Inc., Inc.), Chiba, Japão) e por espectrômetro de massa de plasma acoplado indutivamente (ICP-MS, Agilent Technologies 7300, Santa Clara, CA), análise D/G determinada por espectroscopia Raman (WITec alfa 300, Ulm, Alemanha), a análise estrutural foi realizada com um difratômetro de raios X Rigaku Ultima IV (Tóquio, Japão), potencial zeta medido com um Malvern ZS90, He-Ne 633 laser (UK), a viscosidade medida com um viscosímetro (PCE RVI 6, Southampton Hampshire, UK), a área de superfície medida com um BELSOPR-min II (MicrotracBEL, Osaka, Japão) usando o método Brunauer-Emmett-Teller, e a espessura das camadas de grafeno analisadas com microscopia de força atômica (AFM, Park System NX 10, Seul, Coréia).

Os aerossóis de óxido de grafite foram coletados em uma grade TEM (grade de cobre, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) e analisados usando um microscópio eletrônico de transmissão de emissões de campo (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japão) com um EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) a uma tensão de aceleração de 200 kV (NIOSH 1994). e a espessura das camadas de grafeno analisadas com microscopia de força atômica (AFM, Park System NX 10, Seul, Coréia). Os aerossóis de óxido de grafieno foram coletados em uma grade TEM (grade de cobre, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) e analisados usando um microscópio eletrônico de transmissão de emissão de campo (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japão) com um EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) a uma tensão de aceleração de 200 kV (NIOSH 1994). e a espessura das camadas de grafeno analisadas com microscopia de força atômica (AFM, Park System NX 10, Seul, Coréia).

Os aerossóis de óxido de grafite foram coletados em uma grade TEM (grade de cobre, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) e analisados usando um microscópio eletrônico de transmissão de emissões de campo (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japão) com um EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) a uma tensão de aceleração de 200 kV (NIOSH 1994). UK) a uma tensão acelerada de 200 k V (NIOSH 1994).UK) a uma tensão acelerada de 200 k V (NIOSH 1994).

Geração de aerossóis

Os ratos Sprague-Dawley (SD) machos foram expostos a nanopórax de óxido de grafite durante 5 dias usando um sistema de exposição somente de Nase-only (HCT, Icheon, Coréia). A nanopóra de óxido de grafieno foi gerada usando um atomizador (AG-01, HCT, Icheon, Korea) ( Tabela S1) com ar purificado como gás portador.

Ar fresco foi usado como controle, enquanto diferentes suspensões de água foram usadas para gerar diferentes aerossóis: 0,04 mg/ml para baixa concentração, 0,19 mg/ml para média concentração e 0,77 mg/ml para alta concentração. O fluxo de ar foi mantido a 30 litros por minuto (l/min) usando um controlador de fluxo de massa (MFX, FX-7810CD-4V, AERA, Tóquio, Japão), e a vazão para cada narina foi de 1 l/min. A alimentação AC foi mantida em 99,56 ± 0,07 V (média ± SE). As concentrações alvo de nanopórax de óxido de grafieno foram de 0,625, 2,5 e 10 mg/m 3 para as concentrações baixa, média e alta, respectivamente.

O diâmetro aerodinâmico médio da massa (MMAD) foi medido usando um MOUDI 125NR (impactor em cascata, MSP Co, Shoreview, MN) a uma taxa de fluxo de 10 l/min. Um filtro de folha de alumínio revestido com graxa foi usado em cada estágio para minimizar o ressalto de partículas. A massa de aerossol coletada nos filtros foi determinada como a diferença entre o poste e os pré-pesos dos filtros. O desvio padrão geométrico (GSD) da distribuição foi derivado da distribuição da massa acumulada dos filtros.

Monitoramento do aerossol de óxido de grafite na câmara de inalação

A distribuição granulométrica foi medida utilizando um monitor de poeira (modelo 1.1.09, Grimm Technologies Inc. Douglasville, GA) e um nanopartulador de varredura (SMPS, HCT Co., Ltd., Icheon, Korea). A concentração de massa de óxido de grafieno foi determinada gravimetricamente (como pós-peso menos pré-peso) por amostragem em um filtro de PVC (policloreto de vinila, tamanho: 37 mm e tamanho de poro 5,0 µm) a uma taxa de fluxo de 1,0 L/min.

Análise Elementar de Carbono

Para quantificar o conteúdo de carbono elementar (EC) nos aerossóis de óxido de grafite, filtros de quartzo (filtros de fibra de quartzo de 37 mm de diâmetro, SKC Inc., Eighty-Four, PA, EUA) também foram utilizados para coletar o total de partículas em suspensão (TSP) e analisar a concentração de EC. Os filtros de quartzo foram então analisados para determinar a concentração de massa de EC no ar.

Os filtros foram analisados de acordo com o NIOSH Manual of Analytical Method (NMAM) Método 5040 ( NIOSH, 2003 ) , que é atualmente recomendado pelo NIOSH para avaliar a exposição a CNTs e nanofibras de carbono (CNFs) ( NIOSH, 2013). Uma análise de carbono orgânico (OC) também é usada rotineiramente para caracterizar nanomateriais carbonosos, bem como impurezas carbonosas em nanomateriais de engenharia (ENMs). Neste estudo, o limite de relatório de quantificação (LOQ) para CE, carbono orgânico e carbono total foi de 2 μg, 2 μg, e 4 μg/filtro, respectivamente, e o limite de detecção (LOD) foi de 0,6 μg/filtro para cada categoria de analito.

Animais e condições

Foram obtidos de OrientBio (Seongnam, Coréia) e aclimatados durante duas semanas antes de se iniciar a exposição por inalação. Durante a aclimatação e exposição por inalação, os ratos foram mantidos em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 0,83 °C) e umidificado (47 ± 0,69%) com um ciclo luz-escuro de 12 horas. Os ratos foram alimentados com uma vaca roedora (Woojung BSC, Suwon, Coréia) e água filtrada ad libitum. Durante o período de aclimatação, os animais foram treinados durante 6 h/dia para se adaptarem à câmara de inalação somente para o nariz.

Os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: Grupo de controle (n=15), baixa concentração (n=15), concentração média (n=15), e alta concentração (n=15). Os grupos de baixa, média e alta concentração foram expostos à nanopóra de óxido de grafite 6 h/dia durante 5 dias, enquanto o grupo de controle recebeu ar fresco filtrado. Os animais foram examinados diariamente em busca de evidências de reações tóxicas relacionadas à exposição. Os pesos corporais foram medidos no momento da compra, agrupados, uma vez durante a inalação, e antes da postmortem.

O consumo de ração (g/rato/dia) era medido uma vez por semana. Após os 5 dias de exposição ao óxido de grafeno, os ratos tinham 1, 3 e 21 dias (n = 5 por grupo de tratamento para cada período) para examinar a liberação. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Hanyang.

Pesos dos órgãos, Patologia Total e Histopatologia

Após a coleta de sangue, os ratos foram eutanizados com o anestésico Entobar ® . seguido pela remoção cuidadosa dos testículos, coração, timo, traquéia, pulmões, rins, baço, fígado e cérebro. Os órgãos foram examinados para lesões grosseiras e depois pesados e fixados em uma solução de formalina 10% contendo soro fisiológico neutro com tampão fosfato (PBS).

Para avaliação histopatológica, os testes foram fixados em uma solução Bouin durante a matança, enquanto o pulmão esquerdo foi fixado em uma solução de formalina 10% (BBC Biochemical, Washington, DC) contendo soro fisiológico neutro com tampão fosfato sob 25 cm de pressão de água. Após a fixação dos órgãos em 10% PBS natural por uma semana, eles foram então embutidos em querosene e corados com hematoxilina e eosina (BBC biochemical, Washington, DC). Todos os órgãos animais foram examinados por microscopia leve. O pulmão esquerdo foi dividido em três partes e examinado.

Hematologia e Bioquímica do Sangue

Após uma injeção intraperitoneal do anestésico Entobar ® (1 ml/kg) e antes da eutanásia, foram coletadas amostras de sangue da aorta abdominal em tubos EDTA para ensaio de hematologia e tubos de separação para determinação da bioquímica do sangue .

O sangue foi analisado usando um analisador de sangue (Hitachi 7108, Hitachi, Tokyo, Japão), enquanto a hematologia foi analisada usando um contador de células sanguíneas (Hemavet 0950, CDC Tech., Dayton, OH). A coagulação do sangue foi analisada usando equipamento de coagulação de sangue (ACL700, Instrumentation Laboratory, Bedford, MA).

Lavagem Broncoalveolar (BAL) Análise Celular e Medição de Marcadores Inflamatórios e Citocinas no fluido BAL

No sacrifício, os pulmões direitos foram injetados quatro vezes com alíquotas de 3 ml de tampão fosfato de cálcio quente e magnésio (PBS) (pH 7,4). Os fluidos BAL foram então centrifugados a 500 × g durante 7 min, e as células BAL foram coletadas e ressuspendidas em 1 ml de PBS para avaliação. A contagem total de células foi determinada usando um hemocitômetro. As células foram primeiro esfregadas e depois coradas com Wright Giemsa Sure Stain para permitir a contagem de células totais, macrófagos, células polimorfonucleares (PMNs), e linfócitos.

Duzentas células foram avaliadas para diferenciação celular. Além disso, amostras de BAL também foram analisadas usando um analisador bioquímico de sangue (Hitachi 7108, Hitachi, Japão) para determinar os níveis de desidrogenase láctica (LDH), microalbumina (mALB), proteína micro total (mTP) e nitrogênio uréico no sangue (BUN). As concentrações de citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-1β) no fluido BAL foram determinadas usando um imunoensaio de Quantikine Rat IL-1β/IL-1F2 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) e um imunoensaio de Quantikine Rat TNF-α . medido (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante (princípio: imunoensaio enzimático em sanduíche).

Depósito Pulmonar e Cálculo de Dose

A exposição pulmonar diária por rato foi estimada para 6 h de exposição contínua, 1 min de ventilação de 0,19 l/min ( Whalan et al., 2006 ) e as seguintes propriedades do aerossol (ver seção Resultados) : 203 nm de partículas MMAD, 2,01 GSD , 15,36% de eficiência de deposição pulmonar com base no MPPD (2002) (Dosimetria de Partículas de Múltiplos Percursos) Modelo v.2.0 e concentrações de aerossol de óxido de grafite de 0,76, 2,60 e 9,78 mg/m 3 para as concentrações baixa, média e alta, respectivamente.

Foram feitos os seguintes cálculos:

  • Dose diária depositada (mg/dia) = concentração média de aerossol de óxido de grafieno (mg/m 3 ) × volume minuto (l/min = 0,06 m 3 /h) × duração da exposição (h/dia) × eficiência da deposição (1).
  • Deposição em dose baixa = 0,76 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,008 mg/dia
  • Deposição de dose moderada = 2,60 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,027 mg/dia
  • Deposição em alta dose = 9,78 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,103 mg/dia
  • Dose cumulativa (mg)/animal = dose diária depositada (mg/dia) × número de dias (5).
  • Para baixa exposição: 0,008 × 5 = 0,04 mg
  • Para exposição média: 0,027 × 5 = 0,135 mg
  • Em alta exposição: 0,103 × 5 = 0,515 mg
Análise estatística

A análise estatística dos parâmetros do resultado foi realizada utilizando o SPSS versão 19 (SPSS Inc., Chicago, IL). A análise estatística foi realizada pela análise de variância (ANOVA) após testes de comparação múltipla usando o método T3 da Dunnett. O nível de significância estatística foi definido em p < 0,05, p < 0,01.

Resultados

Propriedades da nanopóra de óxido de grafieno

As propriedades físico-químicas da nanopóra de óxido de grafieno são mostradas na Tabela 1 e na Figura 1. Os teores de carbono e oxigênio foram 42-45% e 35-40%, respectivamente, baseados na análise termogravimétrica (TGA), enquanto as impurezas foram manganês <0,001% e enxofre <2,0%, baseados na espectrometria de emissão óptica por plasma acoplado indutivamente ( ICP-OES). A espessura do óxido de grafeno era de cerca de 1 nm com 1-2 camadas atômicas e o tamanho lateral estava na faixa de 0,5 a 5 μm.

A análise TEM de emissão de campo da nanopóra de óxido de grafieno após a geração do aerossol revelou uma estrutura de plaquetas empilhadas com várias espessuras variando de 5,94 a 209,1 nm (Figura 2). Além disso, a análise TEM-EDS revelou a presença de dois elementos (isto é, C e O) (Figura 2). A Tabela 2 mostra as porcentagens atômicas dos principais componentes do óxido de grafite com base na análise do SDE: carbono (72,69%), oxigênio (27,31%).

Abb1
Fig. 1 Propriedades físico-químicas do óxido de grafeno. XPS, espectroscopia fotoelétrica de raios X; XRD, difração de raios X; TGA, análise termogravimétrica; FT-IR, Fourier transformam espectroscopia infravermelha; UV-vis, espectroscopia ultravioleta-visível.
Abb2
Fig. 2 Análise do óxido de grafeno por FE-TEM (AD) (microscopia eletrônica de transmissão de campo) (×100.000). (EF) EDS spectrometer (espectroscopia dispersiva de energia).

Corona 1

Corona 3

 

Câmara de monitoramento e distribuição de óxido de grafite

As concentrações de massa alvo da nanopóra de óxido de grafieno foram 0,625 mg/m 3 , 2,5 mg/m 3 , e 10 mg/m 3 para as concentrações baixa, média e alta, respectivamente. As concentrações de massa entregues nas câmaras de baixa, média e alta concentração foram 0,76 ± 0,10, 2,60 ± 0,19 e 9,78 ± 0,29 mg/m 3 .Tabela 3), respectivamente. As concentrações numéricas nas câmaras, medidas com um contador de partículas ópticas (OPC), foram de 3,25 × 10 3 ± 1,18 × 10 2 , 6,30 × 10 3 ± 2,90 × 10 2 , e 9,97 × 10 3 ± 1,68 × 10 3 partículas/ cm 3 para as concentrações baixa, média e alta, respectivamente (Tabela 3). As concentrações de número de partículas foram mantidas como mostrado na Figura 3.

A distribuição do tamanho das partículas nas câmaras foi medida utilizando um Sizer de Mobilidade de Varredura (SMPS) (faixa de 5,94 nm - 224,7 nm) e OPC (faixa de 265 nm - 34 μm). O SMPS mostrou um pico em 22,5 nm, 25 nm e 25,9 nm para as concentrações baixa, média e alta, respectivamente (Figura 4A), enquanto o OPC mostrou um pico em 265 nm, 365 nm e 375 nm, respectivamente (Figura 4B). O diâmetro aerodinâmico médio da massa (MMAD) medido com um impactor em cascata MOUDI 125NR de 13 estágios foi de 203 nm com um GSD de 2,01 (Figura 5).

Figur 3
Figura 3: Concentrações de número de partículas em aerossóis de óxido de grafite em câmaras de inalação durante uma exposição de 5 dias medida com o Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) (A) e o Optical Particle Counter (OPC) (B)
Figur 4
Figura 4: Distribuição granulométrica de aerossóis de óxido de grafite em câmaras de inalação medidas com SMPS (A) e OPC (B). As distribuições foram bimodais, com máximos de pico a 20-30 nm (SMPS) e 300-400 nm (OPC), como mostrado na Tabela 3.
Abb 5
Figura 5: Diâmetro aerodinâmico médio de massa (MMAD) (203 nm) e desvio padrão geométrico (GSD) (2,01) de óxido de grafeno aerossolizado medido pelo MOUDI.

tisch 3

Análise Elementar de Carbono

A CE total foi de 0,18 ± 0,20 mg/cm 2 , 1,56 ± 0,54 mg/cm 2 , 3,34 ± 0,71 mg/cm 2 , e 7,25 ± 1,14 mg/cm 2 para as câmaras de controle, baixa, média e alta concentração, respectivamente (Tabela 4).

tabelle 4

Observação de animais, ingestão de ração e efeito sobre o peso corporal e orgânico

Não foram observados efeitos brutos significativos durante a exposição. Também não foram observadas perdas significativas de peso corporal ou mudanças no consumo de alimentos durante os períodos de exposição e recuperação ( Tabela S2 e 3 ). Entretanto, o peso pulmonar direito foi significativamente maior (P < 0,05) para a alta concentração após 1 dia, sugerindo uma verificação adicional da inflamação pela histopatologia e análises de células BAL e fluidos BAL ( Tabela S4 ).

Histopatologia

Enquanto o número de macrófagos alveolares com óxido de grafeno ingerido aumentou de forma dependente da concentração (Figura 6), uma liberação gradual do óxido de grafeno foi observada durante o período de 21 dias pós-exposição. Independentemente disso, alguns macrófagos com óxido de grafeno ingerido ainda persistiram no dia 21 do período pós-exposição (Figura 6, setas vermelhas).

Não foram observadas observações histopatológicas significativas no epitélio periférico das vias aéreas, tecido intersticial, espaço alveolar ou vasculatura no fígado e nos rins. A observação microscópica leve não revelou evidências claras de movimento dos macrófagos ingeridos de óxido de grafeno nos gânglios linfáticos adjacentes aos brônquios. Além disso, não houve resposta histopatológica significativa do parênquima pulmonar, e mesmo com baixa ampliação, foi observada uma resposta exclusivamente adaptativa da depuração dos macrófagos pulmonares (Figura 7). O exame histopatológico do fígado e dos rins não revelou lesões significativas induzidas pelo artigo de teste.

Abade 6
Figura 6: Histopatologia pulmonar em 1, 3, e 21 dias. Os painéis são organizados como dia após a exposição versus concentração. Ampliação 400x. Nenhuma das micrografias mostrou inflamação em bronquíolos ou regiões perivasculares. Não houve proliferação de células fibróticas nos tecidos intersticiais. Macrófagos com óxido de grafeno ingerido foram detectados de forma dependente da concentração. Nenhuma aparência granulomatosa foi observada em várias concentrações durante o período de pós-exposição. As setas vermelhas indicam macrófagos com óxido de grafeno ingerido.
Abade 7
Figura 7: Histopatologia pulmonar após 1, 3 e 21 dias. Os painéis mostram imagens microscópicas de controle e alta concentração em baixa ampliação (100x). Nenhuma das imagens microscópicas mostra inflamação em bronquíolos ou regiões perivasculares ou parênquima pulmonar. As setas vermelhas indicam macrófagos com óxido de grafeno ingerido.
Medição de Marcadores Inflamatórios e Citoquinas

A contagem diferencial de células no BAL não mostrou mudanças significativas no número total de células, macrófagos, linfócitos ou PMN (Tabela 5). Quando os biomarcadores inflamatórios do BAL foram comparados com o grupo controle, um aumento significativo no mTP foi observado no terceiro dia após a exposição para o grupo de baixa concentração.

Novamente, quando comparados com o grupo de controle, todos os grupos expostos mostraram uma diminuição significativa consistente no mALB em cada ponto após a exposição, mas nenhuma mudança significativa no BUN ou LDH. (Tabela 6). Além disso, o fluido BAL não mostrou mudanças significativas nas citocinas IL-1β ou TNF-α durante o período de pós-exposição (Tabela 6).

tabelle 5

tabelle 6

Efeito sobre a coagulação do sangue

Em comparação com o grupo de controle, nenhum dos grupos expostos mostrou qualquer mudança nos marcadores de coagulação de sangue PT e APTT durante o período de 21 dias pós-exposição (Tabela 7).

tabelle 7

Hematologia e Bioquímica do Sangue

A concentração média de hemoglobina corpuscular (MCHC) mostrou uma diminuição significativa (P < 0,01) no grupo de baixa concentração após 1 dia ( Tabela S7 ). Além disso, a MCHC mostrou uma diminuição (P < 0,05) nos grupos de média e alta concentração após 3 dias, mas um aumento (P < 0,05) no grupo de alta concentração após 21 dias ( Tabela S8-9 ). . O volume médio de plaquetas (MPV) mostrou um aumento (P < 0,01) no grupo de baixa concentração depois de 1 dia ( Tabela S7 ) .

A porcentagem de células não manchadas (LUC) também aumentou (P < 0,01) no grupo de baixa concentração após 1 dia e aumentou (P < 0,05) nos grupos de baixa e média concentração após 3 dias ( Tabela S7-8) . O número absoluto de grandes células não manchadas (abs luc) aumentou (P < 0,05) no grupo de concentração média após 3 dias ( Tabela S8 ). Enquanto a LUC mostrou uma tendência consistente de aumentos significativos em todos os pontos de tempo após a exposição, estas mudanças estavam todas dentro da faixa normal dos valores de controle numérico para este ponto final.

O grupo de concentração média apresentou níveis de colesterol mais baixos (CHO) em comparação com o grupo de baixa concentração (p < 0,05) ( Tabela S10 ). O nível de creatina (CRE) também diminuiu (P < 0,05 - 0,01) nos grupos de concentração média e alta após 1 dia ( Tabela S10 ). O fosfato inorgânico (IP) diminuiu significativamente (P < 0,05 - 0,01) em todos os grupos expostos após 1 dia e nos grupos de média e alta concentração (P < 0,05) após 3 dias ( Tabela S10-11 ). O nível de desidrogenase láctica (LDH) diminuiu (P < 0,05) no grupo de alta concentração após 1 dia e diminuiu (P < 0,01) nos grupos de média e alta concentração após 3 dias ( Tabela S10-11). O grupo de alta concentração também apresentou menor nível de LDH do que o grupo de baixa concentração (p < 0,05) ( Tabela S10 ).

O nível de magnésio (MG) diminuiu (P < 0,01) nos grupos de média e alta concentração após 1 dia e diminuiu (P < 0,01) nos grupos de baixa, média e alta concentração após 3 dias . O grupo de média e alta concentração também apresentou MG menor que o grupo de baixa concentração (P < 0,01) ( Tabela S 10-12 ). O nível de triglicérides (TG) aumentou (p < 0,01) no grupo de baixa concentração após 1 dia e aumentou (P < 0,01) no grupo de alta concentração após 3 dias ( Tabela S10-11) . Enquanto os níveis de TG apresentaram aumentos significativos consistentes ao longo dos pontos de tempo após a exposição, estas mudanças estavam dentro da faixa normal dos valores de controle numérico.

O nível de transaminase glutâmica oxidativa (GOT) diminuiu (P < 0,01) no grupo de baixa concentração após 1 dia e aumentou (P < 0,01) no grupo de alta concentração após 3 dias ( Tabela S11 ). O grupo de alta concentração também apresentou GOT menor em comparação com o grupo de baixa concentração (p < 0,05) ( Tabela S10 ). O nível de creatina cinase (CK) diminuiu nos grupos de média e alta concentração após 3 dias (P < 0,01) ( Tabela S11 ). O nível de sódio (Na) diminuiu no grupo de baixa concentração depois de 3 dias (P < 0,05) ( Tabela S11).

Os níveis de albumina (ALB) e fosfatase alcalina (ALP) diminuíram nos grupos de concentração média e baixa, respectivamente, após 21 dias (P < 0,05) ( Tabela S12 ). O nível de glicose (GLU) aumentou nos grupos de média e alta concentração após 21 dias (P < 0,01) ( Tabela S12 ). Entretanto, enquanto foram observados aumentos significativos consistentes em IP, GOT, LDH, MG, CK em todos os pontos de tempo após a exposição, todas estas mudanças estavam dentro da faixa normal dos valores de controle numérico ( Tabela S10-11 ). Consequentemente, não foram observados efeitos significativos de significância toxicológica sobre a função hematológica renal e hepática após a exposição ao óxido de grafeno.

Discussão

Os termos "inovação segura" e "seguro por projeto" são atualmente amplamente utilizados no campo da nanotecnologia para defender considerações de segurança no início do processo de inovação de nanomateriais e produtos nanocapazes ( Park et al., 2017 ) . Os nanomateriais de grafeno são de fato um bom exemplo de inovação segura ou "safe by design". Devido ao forte interesse no desenvolvimento comercial de nanomateriais relacionados a grafenos e à crescente tendência de produção, a avaliação dos riscos associados antes do início da produção é muito importante. Uma recente revisão dos estudos de toxicidade de nanomateriais com base em grafismo em animais de laboratório indicou potenciais toxicidade comportamental, reprodutiva e de desenvolvimento e genotoxicidade ( Ema et al., 2017 ).

Embora a toxicidade aguda por inalação do óxido de grafeno tenha sido descrita como baixa ( Han et al, 2015 ), a toxicidade por inalação repetida do óxido de grafeno ainda não foi estudada. Portanto, o estudo atual, baseado no estudo de inalação de curto prazo de Ma-hock et al (2009), representa um primeiro passo na avaliação dos perigos e na busca de gama para futuros estudos subagudos e subcrônicos. Consequentemente, baseado em análises hematológicas e bioquímicas após a exposição ao óxido de grafeno e durante um período de observação pós-exposição, o atual estudo de inalação de curto prazo não revelou efeitos tóxicos sistêmicos significativos do óxido de grafeno.

Os resultados também mostraram uma tendência semelhante a um estudo anterior de exposição subaguda do grafeno (Kim et al., 2016). O exame histopatológico do fígado e dos rins não revelou alterações histopatológicas significativas no artigo de teste relevante. Além disso, não foram observadas diferenças significativas nas diferenças de células de lavagem broncoalveolares, tais como linfócitos, macrófagos e PMNs. A avaliação das citocinas do fluido BAL (ou seja, IL-1β,TNF-α) também não mostrou mudanças significativas dependentes da concentração durante o período pós-exposição (Tabela 6). Uma resposta de depuração espontânea dos macrófagos alveolares ingeridos de óxido de grafeno foi observada nos pulmões de todos os grupos de concentração durante o período pós-exposição de 21 dias.

A Tabela 8 apresenta uma comparação dos resultados de toxicidade para grafeno e óxido de grafeno em vários estudos de inalação de curto prazo e subaguda com grafeno. O estudo de inalação de grafeno a curto prazo de Shin et al, 2015 e o estudo de inalação subaguda de grafeno de Kim et al, 2016 relataram resultados de toxicidade quase idênticos aos do estudo de inalação aguda de óxido de grafeno de Han et al, 2015 e do atual estudo de inalação aguda de óxido de grafeno a curto prazo. Entretanto, outro estudo de aspiração faríngea de nanoplaca de grafeno com tamanhos laterais de < 2, 5 e 20 µm encontrou marcadores inflamatórios aumentados nos fluidos BAL quando foram usadas nanoplacas de grafite maiores que 5 µm ( Roberts et al., 2016).

Estes diferentes resultados podem ser devidos à distribuição lateral do tamanho do grafeno e do óxido de grafeno. Quando o tamanho lateral era inferior a 5 µm, os macrófagos alveolares imitados com grafeno e óxido de grafeno apresentaram resultados semelhantes com toxicidade mínima. Entretanto, quando o tamanho lateral era maior que 5 μm, o grafeno induziu uma resposta inflamatória no fluido BAL após a exposição ( Ma-hock et al., 2013 ). Nos estudos de Shin et al (2015) e Ma-hock et al (2013), os animais foram expostos a um máximo de 3 µg/m 3 e 10 µg/m 3 por inalação para nanoplacas de grafeno, respectivamente, e permitiram a recuperação por 21 dias. Enquanto os aerossóis de nano placas de grafeno tinham um MMAD semelhante em cada estudo, as respostas inflamatórias foram determinadas pelos diferentes tamanhos laterais das nano placas de grafeno.

Além disso, diferentes métodos de entrega também podem influenciar a resposta inflamatória. A instilação Intratracheal (Shinwald et al., 2012) ou técnicas de aspiração faríngea para entrega aos pulmões de ratos ou ratos pode resultar em maior agregação de nanomateriais e geralmente não reproduzem com precisão os padrões de deposição observados com a exposição por inalação a suspensões aerosolizadas ou nebulizadas de nanomateriais secos.

A principal diferença é que a exposição em bolus (instilação ou aspiração) é uma forma não fisiológica de fornecer um material líquido suspenso dentro de frações de segundo a uma taxa de dose muito alta.enquanto que a inalação fisiológica deposita materiais aerossolizados durante um período de tempo mais longo (dias, semanas ou meses a taxas de dose baixas) (Oberdorster et al., 2015 ). Portanto, a resposta inflamatória induzida após a instilação intratraqueal de óxido de grafeno e a redução do óxido de grafeno em ratos com uma resposta de fase aguda aumentada junto com o soro amilóide A ( Bengston et al., 2017 ) não foi observada no atual estudo de inalação, que não mostrou uma resposta inflamatória marcada.

tablle 8

Com base no estudo de inalação de curto prazo dos autores, também foi concluído um estudo de inalação subcrônica com nano placas de óxido de grafeno, e os resultados mostraram que os macrófagos haviam ingerido partículas em concentrações moderadas e altas como uma resposta espontânea à depuração. Portanto, o NOAEL proposto para o estudo de inalação subcrônica foi de 3,02 mg/m 3 e nenhum órgão alvo foi identificado ( An et al., 2017 ).

As diretrizes recentemente revisadas da OCDE para testes de toxicidade por inalação subaguda e subcrônica agora requerem análises de exposição pulmonar para fornecer informações sobre a deposição pulmonar e retenção de partículas no pulmão no final da exposição e em intervalos de observação pós-exposição ( OECD 2017a ; 2017b ). No estudo atual, foram usadas medições de carbono elementar (EC) do tecido pulmonar de 1 dia a 21 dias para fornecer informações sobre a depuração do óxido de grafeno. Entretanto, não havia tecnologia disponível para analisar a CE do tecido pulmonar. Esta tecnologia foi desenvolvida desde então pelos autores atuais e será utilizada em nossos futuros estudos de inalação de nanomateriais de carbono.

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