Jakie są wnioski z krótkoterminowego badania inhalacyjnego nanopłatków tlenku grafenu?


Nano

Tlenki grafenu posiadają unikalne właściwości fizykochemiczne z ważnymi potencjalnymi zastosowaniami w elektronice, farmacji i medycynie.

Toksyczność inhalacyjna tlenku grafenu

Jednakże, toksyczność tlenku grafenu po ekspozycji inhalacyjnej nie została jeszcze wyjaśniona. W związku z tym w niniejszej pracy przeprowadzono krótkoterminową analizę toksyczności inhalacyjnej tlenku grafenu z wykorzystaniem systemu inhalacji tylko przez nos i samców szczurów Sprague-Dawley.

Łącznie cztery grupy (15 szczurów w każdej grupie) były narażone na: (1) kontrolę (świeże powietrze), (2) niskie stężenie (0,76 ± 0,16 mg/m3), (3) umiarkowane stężenie (2,60 ± 0,19 mg/m3) oraz (4) wysokie stężenie (9,78 ± 0,29 mg/m3). Szczury eksponowano na tlenek grafenu przez 6 h/dzień przez 5 dni, po czym następował okres regeneracji 1, 3 i 21 dni.

Nie zaobserwowano żadnych znaczących zmian w masie ciała lub narządów po krótkotrwałym narażeniu lub w okresie rekonwalescencji. Podobnie, nie wykryto żadnych znaczących ogólnoustrojowych efektów o znaczeniu toksykologicznym w badaniach hematologicznych, markerów zapalnych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), cytokin w płynie BAL lub w badaniach biochemicznych krwi po ekspozycji na tlenek grafenu lub w okresie obserwacji po ekspozycji.

Nie zaobserwowano również istotnych różnic w różnicowaniu się komórek BAL, takich jak limfocyty, makrofagi czy komórki wielojądrowe. W płucach wszystkich grup stężenia od 1 dnia do 21 dni po ekspozycji obserwowano makrofagi pęcherzykowe obciążone tlenkiem grafenu jako spontaniczną reakcję klirensową.

Badanie histopatologiczne wątroby i nerek nie wykazało żadnych istotnych zmian histopatologicznych związanych z badanym artykułem. Co ważne, podobnie jak we wcześniejszych doniesieniach na temat wdychania grafenu, w tym krótkoterminowym badaniu inhalacyjnym przeprowadzonym wyłącznie przez nos zaobserwowano jedynie minimalną lub niezauważalną toksyczność tlenku grafenu w płucach i innych organach.

Wstęp

Grafen definiuje się jako pojedynczą warstwę atomów węgla, przy czym każdy atom jest połączony z trzema sąsiednimi w strukturze plastra miodu (ISO TS 80004-3, 2010). W przypadku tlenku grafenu (GO), epoksydowe (1,2-eterowe) i hydroksylowe grupy funkcyjne są kowalencyjnie związane po obu stronach płaszczyzny podstawowej, natomiast grupy karboksylowe znajdują się na krawędziach (Balapanuru i in., 2010).

Oczekuje się, że ten mocny i lekki nanomateriał będzie wykorzystywany w wielu dziedzinach przemysłu, w tym w zastosowaniach biomedycznych, elektronice, energetyce i czujnikach, ale rodzi to również obawy dotyczące narażenia ludzi oraz zagrożeń środowiskowych i zawodowych (Sanchez et al., 2012; Yang et al., 2015; Lee et al., 2016; Park et al., 2017).

Ekspozycja zawodowa na nanomateriały grafenowe może wystąpić w powietrzu podczas produkcji nanomateriałów grafenowych w procesach utleniania i redukcji, a formami narażonymi mogą być pojedyncze nanopłatki grafenowe, agregaty lub aglomeraty (Lee i in., 2016).

Wcześniej stwierdzono, że tlenek grafenu (rozmiar lateralny 200-500 nm) indukuje cytotoksyczność i genotoksyczność w ludzkich fibroblastach płucnych w sposób zależny od dawki (1-100 μm/ml), przy czym wykazano, że stres oksydacyjny i ładunek powierzchniowy tlenku grafenu pośredniczą w toksyczności (Wang i in., 2013).

Na poziomie komórkowym tlenek grafenu (160 - 780 nm) nie penetrował komórek A549, ale wywoływał stres oksydacyjny w sposób zależny od dawki i powodował niewielką utratę żywotności komórek tylko przy wysokich stężeniach, co sugeruje, że tlenek grafenu jest materiałem stosunkowo bezpiecznym (Chang i in., 2011).

Ponadto, iniekcje tlenku grafenu do żył ogonowych szczurów przez 7 dni w stężeniach 2,5, 5 i 10 mg/kg masy ciała nie powodowały zmian behawioralnych w eksperymentach terenowych i testach funkcjonalnych baterii obserwacyjnych, ale powodowały zapalenie płuc, wątroby i śledziony przy wysokim stężeniu (10 mg/kg). Zastrzyki tlenku grafenu obniżyły również poziom cholesterolu, lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) i lipoproteiny o niskiej gęstości (Li i in., 2016).

Inne badanie dotyczące ostrej toksyczności inhalacyjnej tlenku grafenu również wykazało, że ostra ekspozycja inhalacyjna na tlenek grafenu w stężeniach 0,46 i 3,76 mg/m3 wywołała minimalne odpowiedzi toksyczne w płucach samców szczurów Sprague-Dawley bez zwiększenia markerów zapalnych (Han i in., 2015).

Niezależnie od tego, reaktywność powierzchni, rozmiar i stan rozproszenia nanomateriałów grafenowych odgrywają ważną rolę w wywoływaniu toksyczności i biodystrybucji nanomateriałów grafenowych.

Ponadto, stres oksydacyjny i indukcja odpowiedzi zapalnej są również istotne dla indukcji toksyczności związanej z biodystrybucją nanomateriałów grafenowych (Ema i in., 2017).

Dlatego też, pomimo kilku badań nad ostrą toksycznością inhalacyjną tlenku grafenu, nie przeprowadzono badań nad powtarzalną toksycznością inhalacyjną tlenku grafenu, co jest bardziej istotne dla oceny zagrożeń związanych z powtarzalnym narażeniem na nanomateriały grafenowe w miejscu pracy.

W związku z tym, w niniejszym badaniu zebrano dane niezbędne do oceny bezpieczeństwa tlenku grafenu, w tym toksyczność płucną, toksyczność ogólnoustrojową poprzez hematologię, biochemię krwi i histopatologię w głównych organach po 5-dniowej ekspozycji i po różnych okresach poekspozycyjnych.

Materiały i metody

Charakteryzacja tlenku grafenu

Nanoproszek tlenku grafenu (GO-A200, IGH20160414; grubość 1~2 warstwy atomowej) użyty w eksperymentach został dostarczony przez Grapheneall Co. Ltd. (Gwinsean-gu, Suwon-si, Gyeonggi-do, Korea Południowa). Scharakteryzowano właściwości fizykochemiczne nanoproszku tlenku grafenu, w tym jego zawartość pierwiastków, rozmiar poprzeczny, grubość, stosunek D/G, krystaliczność i przewodnictwo.

Zawartość pierwiastków oznaczono metodą analizy termograwimetrycznej (TG/DTA 7300, Seiko Inc, Chiba, Japonia) i spektrometru mas ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-MS, Agilent Technologies 7300, Santa Clara, CA), stosunek D/G określono metodą spektroskopii Ramana (WITec alpha 300, Ulm, Niemcy), analizę strukturalną wykonano dyfraktometrem rentgenowskim Rigaku Ultima IV (Tokio, Japonia), potencjał zeta zmierzono laserem Malvern ZS90, He-Ne 633 (Wielka Brytania), lepkość mierzono wiskozymetrem (PCE RVI 6, Southampton Hampshire, Wielka Brytania), pole powierzchni mierzono aparatem BELSOPR-min II (MicrotracBEL, Osaka, Japonia) metodą Brunauera-Emmetta-Tellera, a grubość warstw grafenowych analizowano za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM, Park System NX 10, Seul, Korea).

Aerozole tlenku grafenu były zbierane na siatce TEM (siatka miedziana, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) i analizowane przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego z emisją polową (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japonia) z detektorem EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) przy napięciu przyspieszającym 200 kV (NIOSH 1994). a grubość warstw grafenowych analizowano za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM, Park System NX 10, Seul, Korea). Aerozole tlenku grafenu zbierano na siatkę TEM (siatka miedziana, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) i analizowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego z emisją polową (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokio, Japonia) z detektorem EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) przy napięciu przyspieszającym 200 kV (NIOSH 1994). a grubość warstw grafenowych analizowano za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM, Park System NX 10, Seul, Korea).

Aerozole tlenku grafenu były zbierane na siatce TEM (siatka miedziana, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) i analizowane przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego z emisją polową (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokio, Japonia) z detektorem EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) przy napięciu przyspieszającym 200 kV (NIOSH 1994). UK) przy napięciu przyspieszającym 200 k V (NIOSH 1994).UK) przy napięciu przyspieszającym 200 k V (NIOSH 1994).

Wytwarzanie aerozoli

Samce szczurów Sprague-Dawley (SD) poddawano ekspozycji na nanoproszek tlenku grafenu przez 5 dni przy użyciu systemu ekspozycji Nase-only (HCT, Icheon, Korea). Nanoproszek tlenku grafenu generowano za pomocą atomizera (AG-01, HCT, Icheon, Korea) ( Tabela S1) z oczyszczonym powietrzem jako gazem nośnym.

Jako kontrolę stosowano świeże powietrze, natomiast do generowania różnych aerozoli używano różnych zawiesin wodnych: 0,04 mg/ml dla niskiego stężenia, 0,19 mg/ml dla średniego stężenia i 0,77 mg/ml dla wysokiego stężenia. Przepływ powietrza utrzymywano na poziomie 30 litrów na minutę (l/min) za pomocą masowego regulatora przepływu (MFX, FX-7810CD-4V, AERA, Tokio, Japonia), a natężenie przepływu do każdego nozdrza wynosiło 1 l/min. Zasilanie prądem zmiennym utrzymywano na poziomie 99,56 ± 0,07 V (średnia ± SE). Docelowe stężenia nanoproszku tlenku grafenu wynosiły 0,625, 2,5 i 10 mg/m 3 odpowiednio dla niskich, średnich i wysokich stężeń.

Średnią masę średnicy aerodynamicznej (MMAD) mierzono za pomocą MOUDI 125NR (impaktor kaskadowy, MSP Co, Shoreview, MN) przy przepływie 10 l/min. Na każdym etapie stosowano filtr z folii aluminiowej pokryty smarem, aby zminimalizować odbijanie się cząstek. Masę aerozolu zebranego na filtrach określano jako różnicę pomiędzy wagą po i przed filtrami. Geometryczne odchylenie standardowe (GSD) rozkładu otrzymano z kumulatywnego rozkładu masy filtrów.

Monitorowanie aerozolu tlenku grafenu w komorze inhalacyjnej

Rozkład wielkości cząstek mierzono przy użyciu monitora pyłu (model 1.1.09, Grimm Technologies Inc. Douglasville, GA) i skaningowego sizera nanocząstek (SMPS, HCT Co., Ltd., Icheon, Korea).

Analiza węgla elementarnego

W celu ilościowego określenia zawartości węgla pierwiastkowego (EC) w aerozolach tlenku grafenu, użyto również filtrów kwarcowych (filtry z włókna kwarcowego o średnicy 37 mm, SKC Inc., Eighty-Four, PA, USA) do zbierania całkowitych cząstek zawieszonych (TSP) i analizy stężenia EC. Filtry kwarcowe były następnie analizowane w celu określenia masowego stężenia EC w powietrzu.

Filtry analizowano zgodnie z podręcznikiem metod analitycznych NIOSH (NMAM) metoda 5040 ( NIOSH, 2003 ) , która jest obecnie zalecana przez NIOSH do oceny narażenia na CNTs i nanowłókna węglowe (CNFs) ( NIOSH, 2013). Analiza węgla organicznego (OC) jest również rutynowo stosowana w celu scharakteryzowania nanomateriałów węglowych, jak również zanieczyszczeń węglowych w nanomateriałach technicznych (ENM). W tym badaniu, granica raportowania kwantyfikacji (LOQ) dla EC, węgla organicznego i węgla całkowitego wynosiła odpowiednio 2 μg, 2 μg i 4 μg/filtr, a granica wykrywalności (LOD) wynosiła 0,6 μg/filtr dla każdej kategorii analitu.

Zwierzęta i warunki

Sześciotygodniowe samce szczurów SD wolnych od patogenów uzyskano z OrientBio (Seongnam, Korea) i aklimatyzowano przez dwa tygodnie przed rozpoczęciem ekspozycji inhalacyjnej. Podczas aklimatyzacji i ekspozycji inhalacyjnej, szczury były utrzymywane w kontrolowanej temperaturze (22 ± 0,83 °C) i nawilżonym (47 ± 0,69%) środowisku z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność. Szczury karmione były karmą dla gryzoni (Woojung BSC, Suwon, Korea) i filtrowaną wodą ad libitum. W okresie aklimatyzacji, zwierzęta były trenowane przez 6 h/dzień, aby przystosować się do komory inhalacyjnej tylko przez nos.

Szczury zostały losowo podzielone na cztery grupy: Grupa kontrolna (n=15), o niskim stężeniu (n=15), o średnim stężeniu (n=15) i o wysokim stężeniu (n=15). Grupy o niskim, średnim i wysokim stężeniu były eksponowane na nanoproszek tlenku grafenu 6 h/dobę przez 5 dni, podczas gdy grupa kontrolna otrzymywała filtrowane świeże powietrze. Zwierzęta były badane codziennie pod kątem występowania reakcji toksycznych związanych z ekspozycją. Masy ciała mierzono w momencie zakupu, podziału na grupy, jednorazowo podczas inhalacji oraz przed sekcją zwłok.

Spożycie paszy (g/rat/dzień) mierzono raz w tygodniu. Po 5 dniach ekspozycji na tlenek grafenu, szczury miały 1, 3 i 21 dni (n = 5 na grupę dla każdego okresu) na zbadanie klirensu. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee of Hanyang University.

Masy narządów, patologia całkowita i histopatologia

Po pobraniu krwi, szczury poddano eutanazji przy użyciu środka znieczulającego Entobar ® , a następnie ostrożnie usunięto jądra, serce, grasicę, tchawicę, płuca, nerki, śledzionę, wątrobę i mózg. Organy zostały zbadane pod kątem zmian brutto, a następnie zważone i utrwalone w roztworze formaliny 10% zawierającym obojętny buforowany fosforanami roztwór soli (PBS).

Do oceny histopatologicznej jądra utrwalano w roztworze Bouina podczas uśmiercania, natomiast lewe płuco utrwalano w roztworze formaliny 10% (BBC Biochemical, Washington, DC) zawierającym obojętny bufor fosforanowy soli fizjologicznej pod ciśnieniem 25 cm wody. Po utrwaleniu narządów w 10% naturalnym PBS przez tydzień, były one następnie osadzane w nafcie i barwione hematoksyliną i eozyną (BBC biochemical, Washington, DC). Wszystkie narządy zwierząt badano za pomocą mikroskopu świetlnego. Lewe płuco podzielono na trzy części i zbadano.

Hematologia i biochemia krwi

Po dootrzewnowym podaniu środka znieczulającego Entobar ® (1 ml/kg), a przed eutanazją, pobierano próbki krwi z aorty brzusznej do probówek z EDTA do badań hematologicznych i probówek rozdzielających do oznaczeń biochemicznych krwi.

Krew analizowano przy użyciu analizatora krwi (Hitachi 7108, Hitachi, Tokio, Japonia), a hematologię przy użyciu licznika komórek krwi (Hemavet 0950, CDC Tech., Dayton, OH). Koagulację krwi analizowano za pomocą urządzenia do badania krzepliwości krwi (ACL700, Instrumentation Laboratory, Bedford, MA).

Analiza komórek płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) oraz pomiar markerów zapalnych i cytokin w płynie BAL

Przy uśmierceniu, prawe płuca wstrzykiwano czterokrotnie 3 ml porcjami ciepłego, pozbawionego wapnia i magnezu, buforowanego fosforanami roztworu soli (PBS) (pH 7,4). Płyn z BAL odwirowano przy 500 × g przez 7 min, a komórki z BAL zebrano i ponownie zawieszono w 1 ml PBS w celu oceny. Całkowitą liczbę komórek określano za pomocą hemocytometru. Komórki były najpierw rozmazane, a następnie zabarwione barwnikiem Wright Giemsa Sure Stain, aby umożliwić policzenie komórek całkowitych, makrofagów, komórek wielojądrowych (PMN) i limfocytów.

Dwieście komórek oceniono pod kątem różnicowania się komórek. Ponadto, próbki BAL analizowano również przy użyciu biochemicznego analizatora krwi (Hitachi 7108, Hitachi, Japonia) w celu określenia poziomu dehydrogenazy mleczanowej (LDH), mikroalbuminy (mALB), mikro białka całkowitego (mTP) i azotu mocznikowego we krwi (BUN). Stężenia cytokin zapalnych (TNF-α, IL-1β) w płynie z BAL oznaczano przy użyciu testu immunologicznego Quantikine Rat IL-1β/IL-1F2 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) oraz testu immunologicznego Quantikine Rat TNF-α (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) zgodnie z instrukcjami producenta (zasada: test immunologiczny typu sandwich).

Depozycja w płucach i obliczanie dawki

Dzienne narażenie płuc na szczura zostało oszacowane dla 6 h ciągłego narażenia, 1 min wentylacji 0,19 l/min ( Whalan et al., 2006 ) i następujących właściwości aerozolu (patrz sekcja Wyniki): cząstka 203 nm MMAD, 2,01 GSD , 15,36% wydajność depozycji płuc w oparciu o MPPD (2002) (Multiple-Path Particle Dosimetry) Model v.2.0 i stężenia aerozolu tlenku grafenu 0,76, 2,60 i 9,78 mg/m 3 odpowiednio dla niskiego, średniego i wysokiego stężenia.

Dokonano następujących obliczeń:

  • Zdeponowana dawka dzienna (mg/dzień) = średnie stężenie aerozolu tlenku grafenu (mg/m 3 ) × objętość minutowa (l/min = 0,06 m 3 /h) × czas trwania narażenia (h/dzień) × wydajność osadzania (1).
  • Depozycja małej dawki = 0,76 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,008 mg/dzień
  • Depozycja umiarkowanej dawki = 2,60 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,027 mg/dzień
  • Depozycja dużej dawki = 9,78 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,103 mg/dzień
  • Dawka skumulowana (mg)/zwierzę = zdeponowana dawka dzienna (mg/dzień) × liczba dni (5).
  • Dla niskiego narażenia: 0,008 × 5 = 0,04 mg
  • Dla średniego narażenia: 0,027 × 5 = 0,135 mg
  • Przy wysokim narażeniu: 0,103 × 5 = 0,515 mg
Analiza statystyczna

Analizę statystyczną parametrów wynikowych przeprowadzono przy użyciu programu SPSS w wersji 19 (SPSS Inc., Chicago, IL). Analizę statystyczną przeprowadzono metodą analizy wariancji (ANOVA) po przeprowadzeniu testów wielokrotnych porównań metodą T3 Dunnetta. Poziom istotności statystycznej ustalono na p < 0,05, p < 0,01.

Wyniki

Właściwości nanoproszku tlenku grafenu

Właściwości fizykochemiczne nanoproszku tlenku grafenu przedstawiono w tabeli 1 i na rysunku 1. Zawartość węgla i tlenu wynosiła odpowiednio 42-45% i 35-40% na podstawie analizy termograwimetrycznej (TGA), natomiast zawartość zanieczyszczeń manganu <0,001% i siarki <2,0% na podstawie optycznej spektrometrii emisyjnej w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-OES). Grubość tlenku grafenu wynosiła ok. 1 nm z 1-2 warstwami atomowymi, a rozmiar poprzeczny mieścił się w zakresie od 0,5 do 5 μm.

Analiza TEM z emisją polową nanoproszku tlenku grafenu po wytworzeniu aerozolu wykazała obecność ułożonej struktury płytkowej o różnej grubości w zakresie od 5,94 do 209,1 nm (rys. 2). Ponadto, analiza TEM-EDS wykazała obecność dwóch pierwiastków (tj. C i O) (rys. 2). Tabela 2 przedstawia procentowe udziały atomowe głównych składników tlenku grafenu na podstawie analizy EDS: węgiel (72.69%), tlen (27.31%).

Abb1
Rys. 1 Właściwości fizykochemiczne tlenku grafenu. XPS, X-ray photoelectron spectroscopy; XRD, X-ray diffraction; TGA, thermogravimetric analysis; FT-IR, Fourier transform infrared spectroscopy; UV-vis, ultraviolet-visible spectroscopy.
Abb2
Rys. 2 Analiza tlenku grafenu metodą FE-TEM (AD) (transmisyjna mikroskopia elektronowa z emisją polową) (×100,000). (EF) spektrometr EDS (spektroskopia dyspersji energii).

Corona 1

Corona 3

 

Komora Monitorująca i Dystrybucja Tlenku Grafenu

Docelowe stężenia masowe nanoproszku tlenku grafenu wynosiły 0,625 mg/m 3 , 2,5 mg/m 3 i 10 mg/m 3 odpowiednio dla niskich, średnich i wysokich stężeń. Stężenia masowe dostarczane w komorach o niskim, średnim i wysokim stężeniu wynosiły odpowiednio 0,76 ± 0,10, 2,60 ± 0,19 i 9,78 ± 0,29 mg/m 3 .Tabela 3). Stężenia liczbowe w komorach, mierzone za pomocą optycznego licznika cząstek (OPC), wynosiły 3,25 × 10 3 ± 1,18 × 10 2 , 6,30 × 10 3 ± 2,90 × 10 2 oraz 9,97 × 10 3 ± 1,68 × 10 3 cząstek/cm 3 odpowiednio dla niskich, średnich i wysokich stężeń (tabela 3). Stężenia liczby cząstek utrzymywały się na poziomie przedstawionym na rysunku 3.

Rozkład wielkości cząstek w komorach mierzono za pomocą skaningowego miernika cząstek (SMPS) (zakres 5,94 nm - 224,7 nm) i OPC (zakres 265 nm - 34 μm). SMPS wykazał pik przy 22,5 nm, 25 nm i 25,9 nm odpowiednio dla niskich, średnich i wysokich stężeń (rysunek 4A), podczas gdy OPC wykazał pik przy 265 nm, 365 nm i 375 nm odpowiednio (rysunek 4B). Średnia średnica aerodynamiczna masy (MMAD) zmierzona za pomocą 13-stopniowego impaktora kaskadowego MOUDI 125NR wynosiła 203 nm przy GSD równym 2,01 (rysunek 5).

Rys. 3
Rysunek 3: Stężenia liczbowe cząstek w aerozolach tlenku grafenu w komorach inhalacyjnych podczas 5-dniowej ekspozycji mierzone za pomocą skaningowego miernika cząstek (SMPS) (A) i optycznego licznika cząstek (OPC) (B)
Rys. 4
Rys. 4: Rozkład wielkości cząstek aerozoli tlenku grafenu w komorach inhalacyjnych mierzony za pomocą SMPS (A) i OPC (B). Rozkłady były bimodalne, z maksimami przy 20-30 nm (SMPS) i 300-400 nm (OPC), jak pokazano w tabeli 3.
Abb 5
Rysunek 5: Mediana masy średnicy aerodynamicznej (MMAD) (203 nm) i geometryczne odchylenie standardowe (GSD) (2.01) aerozolizowanego tlenku grafenu zmierzone metodą MOUDI.

tisch 3

Analiza węgla elementarnego

Całkowite EC wynosiło 0,18 ± 0,20 mg/cm 2 , 1,56 ± 0,54 mg/cm 2 , 3,34 ± 0,71 mg/cm 2 i 7,25 ± 1,14 mg/cm 2 odpowiednio dla komór kontrolnych, o niskim, średnim i wysokim stężeniu (tab. 4).

tablica 4

Obserwacja zwierząt, spożycie paszy i wpływ na masę ciała i narządów

Podczas ekspozycji nie zaobserwowano znaczących efektów brutto. Nie zaobserwowano również znaczących ubytków masy ciała lub zmian w przyjmowaniu pokarmu podczas okresów ekspozycji i regeneracji ( Tabela S2 i 3 ). Jednakże, masa prawego płuca była znacząco wyższa (P < 0,05) dla wysokiego stężenia po 1 dniu, sugerując dalszą weryfikację zapalenia przez histopatologię i analizę komórek BAL i płynu BAL ( Tabela S4 ).

Histopatologia

Podczas gdy liczba makrofagów pęcherzykowych z połkniętym tlenkiem grafenu wzrastała w sposób zależny od stężenia (Figura 6), obserwowano stopniowe usuwanie tlenku grafenu podczas 21-dniowego okresu poekspozycyjnego. Niezależnie od tego, niektóre makrofagi z połkniętym grafenem nadal utrzymywały się w 21 dniu okresu poekspozycyjnego (Figura 6, czerwone strzałki).

Nie odnotowano istotnych obserwacji histopatologicznych w nabłonku obwodowych dróg oddechowych, tkance śródmiąższowej, przestrzeni pęcherzykowej oraz w naczyniach krwionośnych wątroby i nerek. Obserwacje w mikroskopie świetlnym nie wykazały wyraźnych dowodów przemieszczania się makrofagów po spożyciu tlenku grafenu do węzłów chłonnych sąsiadujących z oskrzelami. Ponadto nie stwierdzono istotnej odpowiedzi histopatologicznej miąższu płuc, a nawet w małym powiększeniu odnotowano wyłącznie adaptacyjną odpowiedź klirensu makrofagów płucnych (ryc. 7). Badanie histopatologiczne wątroby i nerek nie wykazało znaczących zmian wywołanych przez artykuł testowy.

Abb 6
Rys. 6: Histopatologia płuc po 1, 3 i 21 dniach. Panele są zorganizowane jako dzień po ekspozycji vs. stężenie. Powiększenie 400x. Żaden z mikrografów nie wykazał zapalenia w oskrzelach lub regionach okołonaczyniowych. Nie stwierdzono proliferacji komórek włóknistych w tkance śródmiąższowej. Makrofagi z połkniętym tlenkiem grafenu były wykrywane w sposób zależny od stężenia. W różnych stężeniach w całym okresie poekspozycyjnym nie obserwowano wyglądu ziarniniaka. Czerwone strzałki wskazują makrofagi z połkniętym tlenkiem grafenu.
Abb 7
Rysunek 7: Histopatologia płuc po 1, 3 i 21 dniach. Panele przedstawiają obrazy mikroskopowe kontroli i wysokiego stężenia przy małym powiększeniu (100x). Żaden z obrazów mikroskopowych nie wykazuje zapalenia w oskrzelach, regionach okołonaczyniowych lub miąższu płuc. Czerwone strzałki wskazują makrofagi z połkniętym tlenkiem grafenu.
Pomiar markerów stanu zapalnego i cytokin

Różnicowa liczba komórek w BAL nie wykazała istotnych zmian w całkowitej liczbie komórek, makrofagów, limfocytów czy PMN (tab. 5). Porównując biomarkery stanu zapalnego w BAL z grupą kontrolną, zaobserwowano istotny wzrost mTP w 3. dniu po ekspozycji w grupie o niskim stężeniu.

Ponownie, w porównaniu z grupą kontrolną, wszystkie narażone grupy wykazały stały znaczący spadek mALB w każdym punkcie czasowym po ekspozycji, ale bez znaczącej zmiany w BUN lub LDH. (Tabela 6). Ponadto, płyn z BAL nie wykazał istotnych zmian w cytokinach IL-1β lub TNF-α w okresie po ekspozycji (Tabela 6).

tablica 5

tablica 6

Wpływ na krzepliwość krwi

W porównaniu z grupą kontrolną, w żadnej z narażonych grup nie stwierdzono zmian markerów krzepnięcia krwi PT i APTT w 21-dniowym okresie po ekspozycji (Tabela 7).

tablica 7

Hematologia i biochemia krwi

Średnie stężenie hemoglobiny ciałkowej (MCHC) wykazało znaczący spadek (P < 0,01) w grupie o niskim stężeniu po 1 dniu ( Tabela S7 ). Ponadto, MCHC wykazało spadek (P < 0,05) w grupach o średnim i wysokim stężeniu po 3 dniach, ale wzrost (P < 0,05) w grupie o wysokim stężeniu po 21 dniach ( Tabela S8-9 ). Średnia objętość płytek krwi (MPV) wykazała wzrost (P < 0,01) w grupie o niskim stężeniu po 1 dniu ( Tabela S7 ) .

Odsetek nie wybarwionych komórek (LUC) również wzrósł (P < 0,01) w grupie o niskim stężeniu po 1 dniu i wzrósł (P < 0,05) w grupach o niskim i średnim stężeniu po 3 dniach ( Tabela S7-8) . Bezwzględna liczba dużych nie wybarwionych komórek (abs luc) wzrosła (P < 0,05) w grupie o średnim stężeniu po 3 dniach ( Tabela S8 ). Podczas gdy LUC wykazywała stały trend znaczącego wzrostu we wszystkich punktach czasowych po ekspozycji, wszystkie te zmiany mieściły się w normalnym zakresie wartości kontroli numerycznej dla tego punktu końcowego.

Grupa o średnim stężeniu wykazała niższy poziom cholesterolu (CHO) w porównaniu do grupy o niskim stężeniu (p < 0,05) ( Tabela S10 ). Poziom kreatyny (CRE) również zmniejszył się (P < 0,05 - 0,01) w grupach o średnim i wysokim stężeniu po 1 dniu ( Tabela S10 ). Fosforan nieorganiczny (IP) zmniejszył się znacząco (P < 0,05 - 0,01) we wszystkich narażonych grupach po 1 dniu i w grupach o średnim i wysokim stężeniu (P < 0,05) po 3 dniach ( Tabela S10-11 ). Poziom dehydrogenazy mleczanowej (LDH) zmniejszył się (P < 0,05) w grupie o wysokim stężeniu po 1 dniu i zmniejszył się (P < 0,01) w grupach o średnim i wysokim stężeniu po 3 dniach ( Tabela S10-11). Grupa o wysokim stężeniu wykazała również niższy poziom LDH niż grupa o niskim stężeniu (p < 0,05) ( Tabela S10 ).

Poziom magnezu (MG) zmniejszył się (P < 0,01) w grupach o średnim i wysokim stężeniu po 1 dniu i zmniejszył się (P < 0,01) w grupach o niskim, średnim i wysokim stężeniu po 3 dniach . Grupa o średnim i wysokim stężeniu wykazała również niższe MG niż grupa o niskim stężeniu (P < 0,01) ( Tabela S 10-12 ). Poziom triglicerydów (TG) wzrósł (p < 0,01) w grupie o niskim stężeniu po 1 dniu i wzrósł (P < 0,01) w grupie o wysokim stężeniu po 3 dniach ( Tabela S10-11) . Podczas gdy poziomy TG wykazały spójne znaczące wzrosty w różnych punktach czasowych po ekspozycji, zmiany te mieściły się w normalnym zakresie wartości kontroli numerycznej.

Poziom oksydacyjnej transaminazy glutaminianowej (GOT) zmniejszył się (P < 0,01) w grupie o niskim stężeniu po 1 dniu i wzrósł (P < 0,01) w grupie o wysokim stężeniu po 3 dniach ( Tabela S11 ). Grupa o wysokim stężeniu wykazała również niższe GOT w porównaniu z grupą o niskim stężeniu (p < 0,05) ( Tabela S10 ). Poziom kinazy kreatynowej (CK) zmniejszył się w grupach o średnim i wysokim stężeniu po 3 dniach (P < 0,01) ( Tabela S11 ). Poziom sodu (Na) zmniejszył się w grupie o niskim stężeniu po 3 dniach (P < 0,05) ( Tabela S11).

Poziom albuminy (ALB) i fosfatazy alkalicznej (ALP) zmniejszył się odpowiednio w grupach o średnim i niskim stężeniu po 21 dniach (P < 0,05) ( Tabela S12 ). Poziom glukozy (GLU) wzrósł w grupach o średnim i wysokim stężeniu po 21 dniach (P < 0,01) ( Tabela S12 ). Jednakże, podczas gdy stały znaczący wzrost IP, GOT, LDH, MG, CK zaobserwowano we wszystkich punktach czasowych po ekspozycji, wszystkie te zmiany mieściły się w normalnym zakresie liczbowych wartości kontrolnych ( Tabela S10-11 ). W związku z tym, po ekspozycji na tlenek grafenu nie zaobserwowano żadnych istotnych skutków o znaczeniu toksykologicznym dla funkcji hematologicznych nerek i wątroby.

Dyskusja

Terminy "bezpieczna innowacja" i "bezpieczne przez projektowanie" są obecnie szeroko stosowane w dziedzinie nanotechnologii, aby opowiedzieć się za rozważaniami dotyczącymi bezpieczeństwa na wczesnym etapie procesu innowacji nanomateriałów i produktów nanokonfigurowalnych ( Park et al., 2017 ) . Nanomateriały grafenowe są rzeczywiście dobrym przykładem bezpiecznej innowacji lub safe-by-design. Ze względu na duże zainteresowanie komercyjnym rozwojem nanomateriałów związanych z grafenem i tendencją wzrostową w produkcji, ocena powiązanych zagrożeń przed rozpoczęciem produkcji jest bardzo ważna. Niedawny przegląd badań toksyczności nanomateriałów na bazie grafenu u zwierząt laboratoryjnych wskazał na potencjalną toksyczność behawioralną, reprodukcyjną i rozwojową oraz genotoksyczność ( Ema et al., 2017 ).

Podczas gdy ostra toksyczność inhalacyjna tlenku grafenu została opisana jako niska ( Han et al, 2015 ), powtarzalna toksyczność inhalacyjna tlenku grafenu nie została jeszcze zbadana. Dlatego też obecne badanie, oparte na krótkoterminowym badaniu inhalacyjnym Ma-hock et al (2009), stanowi pierwszy krok w ocenie zagrożenia i ustalaniu zakresu dla przyszłych badań podostrych i podprzewlekłych. W związku z tym, na podstawie analiz hematologicznych i biochemicznych po ekspozycji na tlenek grafenu i w okresie obserwacji po ekspozycji, obecne krótkoterminowe badanie inhalacyjne nie wykazało znaczących ogólnoustrojowych efektów toksycznych tlenku grafenu.

Wyniki wykazały również podobny trend do poprzedniego badania podostrego narażenia na grafen (Kim i in., 2016). Badanie histopatologiczne wątroby i nerek nie wykazało istotnych zmian histopatologicznych związanych z artykułem testowym. Ponadto nie zaobserwowano istotnych różnic w różnicach komórek popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych, takich jak limfocyty, makrofagi i PMNs. Ocena cytokin w płynie BAL (tj. IL-1β, TNF-α) również nie wykazała istotnych, zależnych od stężenia zmian w okresie poekspozycyjnym (Tabela 6).Spontaniczną odpowiedź klirensową połkniętych tlenkiem grafenu makrofagów pęcherzykowych obserwowano w płucach wszystkich grup stężeniowych przez cały 21-dniowy okres poekspozycyjny.

Tabela 8 przedstawia porównanie wyników toksyczności dla grafenu i tlenku grafenu w różnych krótkoterminowych i podostrych badaniach inhalacyjnych z grafenem. W krótkoterminowym badaniu inhalacji grafenu przeprowadzonym przez Shin i wsp. w 2015 r. oraz w podostrym badaniu inhalacji grafenu przeprowadzonym przez Kim i wsp. w 2016 r. odnotowano niemal identyczne wyniki toksyczności jak w ostrym badaniu inhalacji tlenku grafenu przeprowadzonym przez Han i wsp. w 2015 r. oraz w obecnym krótkoterminowym badaniu inhalacji tlenku grafenu. Jednakże w innym badaniu aspiracji gardła z nanopłatkami grafenu o rozmiarach bocznych < 2, 5 i 20 µm stwierdzono zwiększoną ilość markerów zapalnych w płynach BAL, gdy stosowano nanopłatki grafitowe większe niż 5 µm ( Roberts i in., 2016).

Te różne wyniki mogą być spowodowane bocznym rozkładem wielkości grafenu i tlenku grafenu. Gdy rozmiar poprzeczny był mniejszy niż 5 μm, makrofagi pęcherzykowe obrazowane grafenem i tlenkiem grafenu wykazywały podobne wyniki z minimalną toksycznością. Jednakże, gdy rozmiar poprzeczny był większy niż 5 μm, grafen indukował odpowiedź zapalną w płynie BAL po ekspozycji ( Ma-hock et al., 2013 ). W badaniach Shin i wsp. (2015) oraz Ma-hock i wsp. (2013) zwierzęta były narażone na maksymalne stężenie odpowiednio 3 µg/m 3 i 10 µg/m 3 przez inhalację na nanopłatki grafenu i pozwolono im dojść do siebie przez 21 dni. Podczas gdy aerozole nanopłatków grafenu miały podobny MMAD w każdym z badań, odpowiedzi zapalne były zdeterminowane przez różne rozmiary poprzeczne nanopłatków grafenu.

Ponadto, różne metody podawania mogą również wpływać na odpowiedź zapalną. Wszczepienie dotchawicze (Shinwald i in., 2012) lub techniki aspiracji przez gardło w celu dostarczenia do płuc szczurów lub myszy mogą powodować większą agregację nanomateriałów i generalnie nie odtwarzają dokładnie wzorców osadzania obserwowanych przy narażeniu inhalacyjnym na suche aerozolizowane lub nebulizowane zawiesiny nanomateriałów.

Główna różnica polega na tym, że ekspozycja bolusowa (instylacja lub aspiracja) jest niefizjologicznym sposobem dostarczania materiału zawieszonego w płynie w ciągu ułamków sekundy przy bardzo wysokiej dose rate.whereas fizjologiczna inhalacja osadza materiały aerozolowe w dłuższym okresie czasu (dni, tygodnie lub miesiące przy niskich dawkach) (Oberdorster et al., 2015 ). Dlatego też odpowiedź zapalna wywołana po śródtchawiczej instylacji tlenku grafenu i zredukowanego tlenku grafenu u myszy ze zwiększoną odpowiedzią ostrej fazy wraz z amyloidem A w surowicy ( Bengston i in., 2017 ) nie została zaobserwowana w obecnym badaniu inhalacyjnym, które nie wykazało wyraźnej odpowiedzi zapalnej.

tablica 8

Na podstawie przeprowadzonego przez autorów krótkoterminowego badania inhalacyjnego, zakończono również subchroniczne badanie inhalacyjne z nanopłatkami tlenku grafenu, a wyniki wykazały, że makrofagi połykały cząstki w umiarkowanych i wysokich stężeniach jako spontaniczną odpowiedź na klirens. Dlatego proponowana wartość NOAEL dla subchronicznego badania inhalacyjnego wynosiła 3,02 mg/m 3 i nie zidentyfikowano narządów docelowych ( An et al., 2017 ).

Niedawno zmienione wytyczne OECD dotyczące badań toksyczności inhalacyjnej podostrej i podprzewlekłej wymagają obecnie analizy ekspozycji płuc w celu dostarczenia informacji na temat depozycji płucnej i zatrzymania cząstek w płucach pod koniec ekspozycji i w odstępach czasu obserwacji po ekspozycji ( OECD 2017a ; 2017b ). W obecnym badaniu wykorzystano pomiary węgla pierwiastkowego (EC) w tkance płucnej od 1 dnia do 21 dni w celu dostarczenia informacji na temat klirensu tlenku grafenu. Nie było jednak dostępnej technologii do analizy EC z tkanki płucnej. Technologia ta została opracowana przez obecnych autorów i będzie stosowana w naszych przyszłych badaniach inhalacyjnych nanomateriałów węglowych.

Referencje

  • An K, Lee S, Sung J, Kim H, Lee J, Song K, 2017. Eine 90-tägige subchronische Inhalationstoxizitätsstudie von Graphenoxidpulver bei F344-Ratten . Toxikologe 2727 [  ]
  • Balapanuru J, Yang JX, Xiao S, Bao Q, Jahan M, Polavarapu L, et al. 2010. Ein ionischer Komplex aus Graphenoxid und organischem Farbstoff mit DNA-sensorischen und optisch einschränkenden Eigenschaften . Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49 :6549-53. [ PubMed ] [  ]
  • Bengston S, Knudsen KB, Kyjovska ZO, Berthing T, Skaug V, Levin M, Koponen IK, Shivayogimath A, Booth TJ, Alonso B, Pesquera A, Zurutuza A, Thomsen B, Troelsen JT, Jacobsen NR, Vogel U, (2017 ) Unterschiede in der Entzündungs - und Akute - Phase - Reaktion , aber ähnliche Genotoxizität bei Mäusen nach pulmonaler Exposition gegenüber Graphenoxid und reduziertem Graphenoxid . PLOS one 12 ( 6 ): e0178355. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Chang Y, Yang ST, Liu JH, Dong E, Wang Y. 2011. In-vitro-Toxizitätsbewertung von Graphenoxid auf A549-Zellen . Toxikologiebriefe 200 : 201-210. [ PubMed ] [  ]
  • Ema M., Gamo M., Honda K. (2017). Eine Übersicht über Toxizitätsstudien zu Nanomaterialien auf Graphenbasis bei Versuchstieren . Regulatorische Toxikologie und Pharmakologie 85 ( 2017 ) 7-24 [ PubMed ] [  ]
  • Han SG, Kim JK, Shin JH, Hwang JH, Lee JS et al. 2015a. Lungenreaktionen von Sprague-Dawley-Ratten bei einmaliger inhalativer Exposition gegenüber Graphenoxid-Nanomaterialien . Biomed res Fat 2015 : 376756 [. PMC darmowy artykuł ] [ PubMed ] [  ]
  • ISO TS 80004-3, 2010. Nanotechnologien-Vokabular - Teil 3: Kohlenstoff- Nanoobjekte . STANDARD Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (Norma Techniczna)
  • Kim JK, Shin JH, Lee JS, Hwang JH, Lee JH, Beak JE, Kim TG, Kim BW, Kim SK, Lee GH, Ahn KH, Han SG, et al. 2015. 28-Tage-Inhalationstoxizität von Graphen-Nanoplättchen bei Sprague-Dawley-Ratten Nanotoxikologie [ PubMed ]
  • Lee JH, Han JH, Kim JH, Kim BW. 2016. Expositionsüberwachung von Arbeitsplätzen zur Herstellung von Graphen-Nanoplättchen Inhal Toxicol 28 ( 6 ): 281-91 [. PubMed ] [  ]
  • Li Y, Wang Y, Liu T, Chen Di, Luo Zhi. 2016. Subakute Toxizitätsstudie von Graphenoxid bei der Sprague-Dawley-Ratte . Int. J. Umwelt. Res. Public Health 13 , 1149. [ Wolny od PMC artykuł ] [ PubMed ] [  ]
  • Ma-Hock L, Burkhardt S, Strauss V, Gamer AO, Wiench K, van Ravenzwaay B, Landsiedel R. 2009. Entwicklung eines Kurzzeit-Inhalationstests an der Ratte mit Nano-Titandioxid als Modellsubstanz . Inhaliere Toxicol 21 :102-18. [ PubMed ] [  ]
  • Ma-Hock L, Strauss V, Treumann S, Kuttler K, Wohlleben W, Hofmann T, et al. 2013. Vergleichende Inhalationstoxizität von mehrwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen, Graphen, Graphit-Nanoplättchen und Ruß mit geringer Oberfläche . Teil Fiber Toxicol 10 : 23. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Mercer RR, Scabilloni JF, Hubbs AF, Battelli LA, McKinney W, Friend S, et al. 2013. Verteilung und fibrotische Reaktion nach inhalativer Exposition gegenüber mehrwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen . Teil Fiber Toxicol 10 : 33. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • MPPD (Multiple-Path Particle Dosimetry) Model v.2.0, 2002. ARA, NM. Nationales Toxikologieprogramm , US-Gesundheitsministerium,  ]
  • NIOSH (Nationales Institut für Arbeitssicherheit und Gesundheitsschutz). 2003. Podręcznik metod analitycznych (NMAM) Methode 5040: Elementarer Kohlenstoff . Cincinnati, OH: NIOSH. [  ]
  • NIOSH (Nationales Institut für Arbeitssicherheit und Gesundheitsschutz). 2013. Current Intelligence Bulletin 65: Berufliche Exposition gegenüber Kohlenstoff-Nanoröhrchen und -Nanofasern . Cincinnati, OH: NIOSH. [  ]
  • Oberdorster G, Castranova V, Asgharian B, Sayre P, (2015). Inhalative Exposition gegenüber Kohlenstoffnanoröhren (CNT) und Kohlenstoffnanofasern (CNF): Methodik und Dosimetrie . J Toxicol Environ Health B Crit Rev . 2015; 18 ( 0 ): 121-212. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • OECD (Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung), (2017a). OECD-Richtlinie für die Prüfung von Chemikalien: 28-tägige (subakute) Inhalationstoxizitätsstudie , OECD, Paris [  ]
  • OEC; D (Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung), (2017b). OECD-Leitlinie für die Prüfung von Chemikalien: 90-tägige (subchronische) Inhalationstoxizitätsstudie , OECD, Paris [  ]
  • Park MVDZ, Bleeker EAJ, Brand W, Casse FR, van Elk M, Gosens I, de Jong WH, Meesters JAJ, Peijnenburg WJGM, Quik JTK, Vandebriel RJ, Sips AJAM (2017). Überlegungen für sichere Innovation: Der Fall von Graphen . ACS Nano 11 : 8574-9593 [. PubMed ] [  ]
  • Roberts JR, Mercer RR, Stefaniak AB, Seehra MS, Geddam UK, Chaudhuri IS, Kyrlidis A, Kodali VK, Sager T, Kenyon A, Bilgesu SA, Eye T, Scabilloni JF, Leonard SS, Fix NR, Schwegler-Berry D, Farris BY, Wolfarth MG, Porter DW, Castranova V, Erdely A. 2016. Bewertung der pulmonalen und systemischen Toxizität nach Lungenexposition gegenüber Graphit-Nanoplatten: ein Mitglied der Graphen-basierten Nanomaterialfamilie . Span- und Faser Toxicology , 13 : 34. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Sanchez VC, Jachak A, Hurt RH, Kane AB. 2012. Biologische Wechselwirkungen von Nanomaterialien der Graphenfamilie: eine interdisziplinäre Übersicht . ChemRes Toxicol 25 :15-34. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Schinwald A, Murphy F, Askounis A. Koutsos V, Sefiane K. Minimale Oxidation und Inflammogenität von reinem Graphen mit Aufenthalt in der Lunge . Nanotoxikologie 8 ( 8 ): 824-832. [ PubMed ] [  ]
  • Shin JH, Han SG, Kim JK, Kim BW, Hwang JH, Lee JS et al. 2015. 5-tägige Studie mit wiederholter Inhalation und 28-tägiger Postexpositionsstudie von Graphen . Nanotoxikologie 9 :1023-31. [ PubMed ] [  ]
  • Anxin Wang, Pu Kefeng, Dong Bing, Liu Yang. 2013. Rolle der Oberflächenladung und des oxidativen Stresses bei der Zytotoxität und Genotoxität von Graphenoxid gegenüber menschlichen Lungenfibroblastenzellen [ PubMed ]
  • Whalan JE, Foureman GL, Vandenberg JJ. 2006. Inhalationsrisikobewertung bei der Umweltschutzbehörde In: Salem H, Katz SA, Hrsg. Inhalationstoxikologie . 2. Aufl. Boca Raton, FL: CRC Press, 26-8. [  ]
  • Yang S, Brüller ZS, Wu Z, Liu K, Parvez R, Dong F, Richard P, Samori X, Feng K, Müllen K. 2015. Organische Radikal-unterstützte elektrochemische Exfoliation für die skalierbare Production von hochwertigem Graphen . Marmelade. Chem.-Nr. Soc , 137 ( 43 ), S. 13927-13932 [ PubMed ] [  ]