Quali sono le conclusioni dello studio di inalazione a breve termine di nanoparticelle di ossido di grafene?


Nano

Gli ossidi di grafene possiedono proprietà fisico-chimiche uniche con importanti applicazioni potenziali in elettronica, farmaceutica e medicina.

Tossicità per inalazione dell'ossido di grafene

Tuttavia, la tossicità dopo l'esposizione per inalazione dell'ossido di grafene non è stata ancora chiarita. Pertanto, in questo studio, è stata eseguita un'analisi a breve termine della tossicità per inalazione dell'ossido di grafene utilizzando un sistema di inalazione solo per il naso e ratti maschi Sprague-Dawley.

Un totale di quattro gruppi (15 ratti per gruppo) sono stati esposti a: (1) controllo (aria fresca), (2) bassa concentrazione (0,76 ± 0,16 mg/m3), (3) concentrazione moderata (2,60 ± 0,19 mg/m3), e (4) alta concentrazione (9,78 ± 0,29 mg/m3). I ratti sono stati esposti all'ossido di grafene per 6 ore al giorno per 5 giorni, seguiti da periodi di recupero di 1, 3 e 21 giorni.

Non sono stati osservati cambiamenti significativi nel peso del corpo o degli organi dopo l'esposizione a breve termine o durante il periodo di recupero. Allo stesso modo, nessun effetto sistemico significativo di rilevanza tossicologica è stato rilevato nei test ematologici, nei marcatori infiammatori nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL), nelle citochine nel liquido BAL o nei test biochimici del sangue dopo l'esposizione all'ossido di grafene o durante il periodo di osservazione post-esposizione.

Inoltre, non sono state osservate differenze significative nella differenziazione delle cellule BAL, come linfociti, macrofagi o cellule polimorfonucleate. Macrofagi alveolari carichi di ossido di grafene come risposta spontanea di clearance sono stati osservati nei polmoni di tutti i gruppi di concentrazione da 1 giorno a 21 giorni dopo l'esposizione.

L'esame istopatologico del fegato e dei reni non ha rivelato lesioni istopatologiche significative relative all'articolo di prova. È importante notare che, come nei precedenti rapporti sull'inalazione del grafene, solo una tossicità minima o impercettibile dell'ossido di grafene è stata osservata nei polmoni e in altri organi in questo studio di inalazione a breve termine condotto solo attraverso il naso.

Introduzione

Il grafene è definito come un singolo strato di atomi di carbonio, con ogni atomo collegato a tre vicini in una struttura a nido d'ape (ISO TS 80004-3, 2010). Nel caso dell'ossido di grafene (GO), i gruppi funzionali epossido (1,2-etere) e idrossile sono legati covalentemente su ogni lato del piano basale, mentre i gruppi carbossilici si trovano ai bordi (Balapanuru et al., 2010).

Ci si aspetta che questo nanomateriale forte e leggero venga utilizzato in molti campi industriali, tra cui applicazioni biomediche, elettronica, energia e sensori, ma questo solleva anche preoccupazioni circa l'esposizione umana e i rischi ambientali e professionali (Sanchez et al., 2012; Yang et al., 2015; Lee et al., 2016; Park et al., 2017).

L'esposizione professionale ai nanomateriali di grafene può verificarsi in aria durante la produzione di nanomateriali di grafene attraverso processi di ossidazione e riduzione, e le forme esposte possono includere singole nanopiastrine di grafene, aggregati o agglomerati (Lee et al., 2016).

L'ossido di grafene (200-500 nm di dimensione laterale) è stato precedentemente trovato per indurre citotossicità e genotossicità nei fibroblasti polmonari umani in modo dose-dipendente (1-100 μm/ml), con lo stress ossidativo e la carica superficiale dell'ossido di grafene dimostrato di mediare la tossicità (Wang et al., 2013).

A livello cellulare, l'ossido di grafene (160 - 780 nm) non ha penetrato le cellule A549, ma ha causato stress ossidativo in modo dose-dipendente e ha provocato una leggera perdita di vitalità cellulare solo ad alte concentrazioni, suggerendo che l'ossido di grafene è un materiale relativamente sicuro (Chang et al., 2011).

Inoltre, le iniezioni di ossido di grafene nelle vene della coda dei ratti per 7 giorni a concentrazioni di 2,5, 5 e 10 mg/kg di peso corporeo non hanno causato cambiamenti comportamentali negli esperimenti sul campo e nei test della batteria funzionale di osservazione, ma hanno causato infiammazione dei polmoni, del fegato e della milza ad una concentrazione elevata (10 mg/kg). Le iniezioni di ossido di grafene hanno anche diminuito i livelli di colesterolo, lipoproteine ad alta densità (HDL) e lipoproteine a bassa densità (Li et al., 2016).

Un altro studio sulla tossicità acuta per inalazione dell'ossido di grafene ha anche mostrato che l'esposizione acuta per inalazione all'ossido di grafene a concentrazioni di 0,46 e 3,76 mg/m3 ha indotto risposte tossiche minime nei polmoni di ratti maschi Sprague-Dawley senza aumentare i marcatori infiammatori (Han et al., 2015).

Indipendentemente da ciò, la reattività di superficie, la dimensione e lo stato di dispersione dei nanomateriali di grafene giocano ruoli importanti nell'indurre la tossicità e la biodistribuzione dei nanomateriali di grafene.

Inoltre, lo stress ossidativo e l'induzione della risposta infiammatoria sono anche importanti per l'induzione della tossicità legata alla biodistribuzione dei nanomateriali di grafene (Ema et al., 2017).

Pertanto, nonostante diversi studi sulla tossicità acuta per inalazione dell'ossido di grafene, non ci sono stati studi sulla tossicità ripetuta per inalazione dell'ossido di grafene, che è più rilevante per valutare i pericoli dell'esposizione ripetuta ai nanomateriali di grafene sul posto di lavoro.

Di conseguenza, questo studio ha raccolto i dati necessari per una valutazione della sicurezza dell'ossido di grafene, compresa la tossicità polmonare, la tossicità sistemica attraverso l'ematologia, la biochimica del sangue e l'istopatologia nei principali organi dopo 5 giorni di esposizione e dopo vari periodi post-esposizione.

Materiali e metodi

Caratterizzazione dell'ossido di grafene

La nanopolvere di ossido di grafene (GO-A200, IGH20160414; spessore 1~2 strato atomico) utilizzata negli esperimenti è stata fornita dalla Grapheneall Co. Ltd. (Gwinsean-gu, Suwon-si, Gyeonggi-do, Corea del Sud). Le proprietà fisico-chimiche della nanopolvere di ossido di grafene sono state caratterizzate, compreso il suo contenuto elementare, la dimensione laterale, lo spessore, il rapporto D/G, la cristallinità e la conduttività.

I contenuti elementari sono stati determinati mediante analisi termogravimetrica (TG/DTA 7300, Seiko Inc, Chiba, Giappone) e spettrometro di massa a plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS, Agilent Technologies 7300, Santa Clara, CA), il rapporto D/G determinato mediante spettroscopia Raman (WITec alpha 300, Ulm, Germania), l'analisi strutturale è stata eseguita con un diffrattometro a raggi X Rigaku Ultima IV (Tokyo, Giappone), il potenziale zeta misurato con un Malvern ZS90, He-Ne 633 laser (Regno Unito), la viscosità misurata con un viscosimetro (PCE RVI 6, Southampton Hampshire, Regno Unito), l'area superficiale misurata con un BELSOPR-min II (MicrotracBEL, Osaka, Giappone) utilizzando il metodo Brunauer-Emmett-Teller, e lo spessore degli strati di grafene analizzati con microscopia a forza atomica (AFM, Park System NX 10, Seoul, Corea).

Gli aerosol di ossido di grafene sono stati raccolti su una griglia TEM (griglia di rame, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) e analizzati utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione a emissione di campo (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Giappone) con un EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) a una tensione di accelerazione di 200 kV (NIOSH 1994). e lo spessore degli strati di grafene analizzati con la microscopia a forza atomica (AFM, Park System NX 10, Seoul, Corea). Gli aerosol di ossido di grafene sono stati raccolti su una griglia TEM (griglia di rame, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) e analizzati utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione a emissione di campo (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Giappone) con un EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) a una tensione di accelerazione di 200 kV (NIOSH 1994). e lo spessore degli strati di grafene analizzati con la microscopia a forza atomica (AFM, Park System NX 10, Seoul, Corea).

Gli aerosol di ossido di grafene sono stati raccolti su una griglia TEM (griglia di rame, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) e analizzati utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione a emissione di campo (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Giappone) con un EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) a una tensione accelerante di 200 kV (NIOSH 1994). UK) ad una tensione di accelerazione di 200 k V (NIOSH 1994).UK) ad una tensione di accelerazione di 200 k V (NIOSH 1994).

Generazione di aerosol

I ratti maschi Sprague-Dawley (SD) sono stati esposti alla nanopolvere di ossido di grafene per 5 giorni utilizzando un sistema di esposizione Nase-only (HCT, Icheon, Corea). La nanopolvere di ossido di grafene è stata generata utilizzando un atomizzatore (AG-01, HCT, Icheon, Corea) (Tabella S1) con aria purificata come gas vettore.

L'aria fresca è stata usata come controllo, mentre diverse sospensioni d'acqua sono state usate per generare diversi aerosol: 0,04 mg/ml per la bassa concentrazione, 0,19 mg/ml per la media concentrazione e 0,77 mg/ml per l'alta concentrazione. Il flusso d'aria è stato mantenuto a 30 litri al minuto (l/min) utilizzando un regolatore di flusso di massa (MFX, FX-7810CD-4V, AERA, Tokyo, Giappone), e la portata di ogni narice era di 1 l/min. L'alimentazione AC è stata mantenuta a 99,56 ± 0,07 V (media ± SE). Le concentrazioni target della nanopolvere di ossido di grafene erano 0,625, 2,5 e 10 mg/m 3 per le concentrazioni basse, medie e alte, rispettivamente.

Il diametro aerodinamico mediano di massa (MMAD) è stato misurato utilizzando un MOUDI 125NR (impattatore a cascata, MSP Co, Shoreview, MN) a una portata di 10 l/min. Un filtro in foglio di alluminio rivestito di grasso è stato utilizzato in ogni fase per minimizzare il rimbalzo delle particelle. La massa di aerosol raccolta sui filtri è stata determinata come la differenza tra i pesi post e pre dei filtri. La deviazione standard geometrica (GSD) della distribuzione è stata derivata dalla distribuzione cumulativa della massa dei filtri.

Monitoraggio dell'aerosol di ossido di grafene nella camera di inalazione

La distribuzione delle dimensioni delle particelle è stata misurata utilizzando un monitor per la polvere (modello 1.1.09, Grimm Technologies Inc. Douglasville, GA) e un dimensionatore di nanoparticelle a scansione (SMPS, HCT Co., Ltd., Icheon, Corea). La concentrazione di massa dell'ossido di grafene è stata determinata gravimetricamente (come post-peso meno pre-peso) campionando su un filtro in PVC (cloruro di polivinile, dimensione: 37 mm e dimensione dei pori 5,0 µm) ad una velocità di flusso di 1,0 L/min.

Analisi del carbonio elementare

Per quantificare il contenuto di carbonio elementare (EC) negli aerosol di ossido di grafene, sono stati utilizzati anche filtri di quarzo (filtri in fibra di quarzo di 37 mm di diametro, SKC Inc., Eighty-Four, PA, USA) per raccogliere le particelle totali sospese (TSP) e analizzare la concentrazione di EC. I filtri di quarzo sono stati poi analizzati per determinare la concentrazione di massa di EC nell'aria.

I filtri sono stati analizzati secondo il NIOSH Manual of Analytical Method (NMAM) Method 5040 (NIOSH, 2003), che è attualmente raccomandato dal NIOSH per valutare l'esposizione a CNT e nanofibre di carbonio (CNF) (NIOSH, 2013). Un'analisi del carbonio organico (OC) è anche utilizzata di routine per caratterizzare i nanomateriali carboniosi e le impurità carboniose nei nanomateriali ingegnerizzati (ENM). In questo studio, il limite di segnalazione della quantificazione (LOQ) per CE, carbonio organico e carbonio totale era di 2 μg, 2 μg e 4 μg/filtri, rispettivamente, e il limite di rilevazione (LOD) era di 0,6 μg/filtri per ogni categoria di analita.

Animali e condizioni

I ratti SD maschi di sei settimane, privi di patogeni specifici, sono stati ottenuti da OrientBio (Seongnam, Corea) e acclimatati per due settimane prima di iniziare l'esposizione per inalazione. Durante l'acclimatazione e l'esposizione per inalazione, i ratti sono stati mantenuti in un ambiente a temperatura controllata (22 ± 0.83 °C) e umidificato (47 ± 0.69%) con un ciclo luce-buio di 12 ore. I ratti sono stati alimentati con mangime per roditori (Woojung BSC, Suwon, Corea) e acqua filtrata ad libitum. Durante il periodo di acclimatazione, gli animali sono stati addestrati per 6 h/giorno per adattarsi alla camera di inalazione solo naso.

I ratti sono stati divisi a caso in quattro gruppi: Gruppo di controllo (n=15), bassa concentrazione (n=15), media concentrazione (n=15) e alta concentrazione (n=15). I gruppi a bassa, media e alta concentrazione sono stati esposti alla nanopolvere di ossido di grafene 6 ore al giorno per 5 giorni, mentre il gruppo di controllo ha ricevuto aria fresca filtrata. Gli animali sono stati esaminati quotidianamente per l'evidenza di reazioni tossiche legate all'esposizione. Il peso del corpo è stato misurato al momento dell'acquisto, del raggruppamento, una volta durante l'inalazione e prima dell'autopsia.

L'assunzione di cibo (g/ratto/giorno) è stata misurata una volta alla settimana. Dopo i 5 giorni di esposizione all'ossido di grafene, ai ratti sono stati concessi 1, 3 e 21 giorni (n = 5 per gruppo di trattamento per ogni periodo) per esaminare la clearance. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Hanyang University.

Pesi d'organo, patologia totale e istopatologia

Dopo la raccolta del sangue, i ratti sono stati eutanasia con l'anestetico Entobar ®. seguita dalla rimozione accurata dei testicoli, cuore, timo, trachea, polmoni, reni, milza, fegato e cervello. Gli organi sono stati esaminati per lesioni grossolane e poi pesati e fissati in una soluzione di formalina 10% contenente fosfato neutro a base di soluzione salina (PBS).

Per la valutazione istopatologica, i testicoli sono stati fissati in una soluzione di Bouin durante l'uccisione, mentre il polmone sinistro è stato fissato in una soluzione di formalina 10% (BBC Biochemical, Washington, DC) contenente soluzione salina neutra a base di fosfato sotto una pressione di 25 cm. Dopo la fissazione degli organi in 10% PBS naturale per una settimana, sono stati poi incorporati in cherosene e colorati con ematossilina ed eosina (BBC biochemical, Washington, DC). Tutti gli organi degli animali sono stati esaminati al microscopio ottico. Il polmone sinistro è stato diviso in tre parti ed esaminato.

Ematologia e biochimica del sangue

Dopo un'iniezione intraperitoneale dell'anestetico Entobar ® (1 ml/kg) e prima dell'eutanasia, i campioni di sangue sono stati raccolti dall'aorta addominale in provette EDTA per il test ematologico e provette di separazione per la determinazione della biochimica del sangue.

Il sangue è stato analizzato utilizzando un analizzatore di sangue (Hitachi 7108, Hitachi, Tokyo, Giappone), mentre l'ematologia è stata analizzata utilizzando un contacellule (Hemavet 0950, CDC Tech., Dayton, OH). La coagulazione del sangue è stata analizzata utilizzando un'apparecchiatura per la coagulazione del sangue (ACL700, Instrumentation Laboratory, Bedford, MA).

Analisi delle cellule del lavaggio broncoalveolare (BAL) e misurazione dei marcatori infiammatori e delle citochine nel liquido BAL

Al sacrificio, i polmoni di destra sono stati iniettati quattro volte con aliquote 3 ml di calcio caldo e magnesio-free fosfato-buffered salina (PBS) (pH 7.4). I fluidi BAL sono stati poi centrifugati a 500 × g per 7 min, e le cellule BAL sono stati raccolti e risospesi in 1 ml di PBS per la valutazione. Il conteggio delle cellule totali è stato determinato utilizzando un emocitometro. Le cellule sono state prima strisciate e poi colorate con Wright Giemsa Sure Stain per consentire il conteggio delle cellule totali, macrofagi, cellule polimorfonucleate (PMN) e linfociti.

Duecento cellule sono state valutate per la differenziazione cellulare. Inoltre, i campioni BAL sono stati anche analizzati utilizzando un analizzatore di sangue biochimico (Hitachi 7108, Hitachi, Giappone) per determinare i livelli di lattato deidrogenasi (LDH), microalbumina (mALB), micro proteina totale (mTP), e azoto ureico nel sangue (BUN). Le concentrazioni di citochine infiammatorie (TNF-α, IL-1β) nel fluido BAL sono state determinate utilizzando un Quantikine Rat IL-1β/IL-1F2 immunoassay (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) e un Quantikine Rat TNF-α immunoassay . misurato (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) secondo le istruzioni del produttore (principio: sandwich immunoassay enzimatico).

Deposizione polmonare e calcolo della dose

L'esposizione polmonare giornaliera per ratto è stata stimata per 6 ore di esposizione continua, 1 min di ventilazione di 0,19 l/min (Whalan et al., 2006) e le seguenti proprietà dell'aerosol (vedi sezione Risultati): MMAD di particelle da 203 nm, 2,01 GSD, efficienza di deposizione polmonare 15,36% basata su MPPD (2002) (Multiple-Path Particle Dosimetry) Model v.2.0 e concentrazioni di aerosol di ossido di grafene di 0,76, 2,60 e 9,78 mg/m 3 per la concentrazione bassa, media e alta, rispettivamente.

Sono stati fatti i seguenti calcoli:

  • Dose giornaliera depositata (mg/giorno) = concentrazione media di aerosol di ossido di grafene (mg/m 3 ) × volume minuto (l/min = 0,06 m 3 /h) × durata dell'esposizione (h/giorno) × efficienza di deposizione (1).
  • Deposito a bassa dose = 0,76 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,008 mg/giorno
  • Deposito di dose moderata = 2,60 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,027 mg/giorno
  • Deposito ad alta dose = 9,78 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,103 mg/giorno
  • Dose cumulativa (mg)/animale = dose giornaliera depositata (mg/giorno) × numero di giorni (5).
  • Per una bassa esposizione: 0,008 × 5 = 0,04 mg
  • Per l'esposizione media: 0,027 × 5 = 0,135 mg
  • Ad alta esposizione: 0,103 × 5 = 0,515 mg
Analisi statistica

L'analisi statistica dei parametri di risultato è stata eseguita utilizzando SPSS versione 19 (SPSS Inc., Chicago, IL). L'analisi statistica è stata eseguita mediante analisi della varianza (ANOVA) dopo test di confronto multiplo utilizzando il metodo T3 di Dunnett. Il livello di significatività statistica è stato fissato a p < 0,05, p < 0,01.

Risultati

Proprietà della nanopolvere di ossido di grafene

Le proprietà fisico-chimiche della nanopolvere di ossido di grafene sono mostrate nella tabella 1 e nella figura 1. I contenuti di carbonio e ossigeno erano 42-45% e 35-40%, rispettivamente, in base all'analisi termogravimetrica (TGA), mentre le impurità erano manganese <0.001% e zolfo <2.0%, in base alla spettrometria di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES). Lo spessore dell'ossido di grafene era di circa 1 nm con 1-2 strati atomici e la dimensione laterale era compresa tra 0,5 e 5 μm.

L'analisi TEM a emissione di campo della nanopolvere di ossido di grafene dopo la generazione di aerosol ha rivelato una struttura a piastrine impilate con vari spessori che vanno da 5,94 a 209,1 nm (Figura 2). Inoltre, l'analisi TEM-EDS ha rivelato la presenza di due elementi (cioè, C e O) (Figura 2). La tabella 2 mostra le percentuali atomiche dei principali componenti dell'ossido di grafene basate sull'analisi EDS: carbonio (72.69%), ossigeno (27.31%).

Abb1
Fig. 1 Proprietà fisico-chimiche dell'ossido di grafene. XPS, spettroscopia fotoelettronica a raggi X; XRD, diffrazione a raggi X; TGA, analisi termogravimetrica; FT-IR, spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier; UV-vis, spettroscopia ultravioletta-visibile.
Abb2
Fig. 2 Analisi dell'ossido di grafene mediante FE-TEM (AD) (microscopia elettronica a emissione di campo) (×100.000). (EF) Spettrometro EDS (spettroscopia a dispersione di energia).

Corona 1

Corona 3

 

Camera di monitoraggio e distribuzione dell'ossido di grafene

Le concentrazioni di massa target della nanopolvere di ossido di grafene erano 0,625 mg/m 3 , 2,5 mg/m 3 , e 10 mg/m 3 per le concentrazioni basse, medie e alte, rispettivamente. Le concentrazioni di massa consegnate nelle camere a bassa, media e alta concentrazione erano 0,76 ± 0,10, 2,60 ± 0,19 e 9,78 ± 0,29 mg/m 3 .Tabella 3), rispettivamente. Le concentrazioni di numero nelle camere, misurate con un contatore ottico di particelle (OPC), erano 3,25 × 10 3 ± 1,18 × 10 2 , 6,30 × 10 3 ± 2,90 × 10 2 , e 9,97 × 10 3 ± 1,68 × 10 3 particelle/ cm 3 per le concentrazioni basse, medie e alte, rispettivamente (Tabella 3). Le concentrazioni del numero di particelle sono state mantenute come mostrato nella Figura 3.

La distribuzione delle dimensioni delle particelle nelle camere è stata misurata utilizzando uno Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) (range 5.94 nm - 224.7 nm) e OPC (range 265 nm - 34 μm). Il SMPS ha mostrato un picco a 22,5 nm, 25 nm e 25,9 nm per le concentrazioni basse, medie e alte, rispettivamente (Figura 4A), mentre l'OPC ha mostrato un picco a 265 nm, 365 nm e 375 nm, rispettivamente (Figura 4B). Il diametro aerodinamico mediano di massa (MMAD) misurato con un impattatore a cascata MOUDI 125NR a 13 stadi era di 203 nm con un GSD di 2,01 (Figura 5).

Figur 3
Figura 3: Concentrazioni di numero di particelle negli aerosol di ossido di grafene nelle camere di inalazione durante un'esposizione di 5 giorni misurata con lo Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) (A) e il contatore ottico di particelle (OPC) (B)
Figur 4
Figura 4: Distribuzione granulometrica degli aerosol di ossido di grafene in camere di inalazione misurata con SMPS (A) e OPC (B). Le distribuzioni erano bimodali, con picchi massimi a 20-30 nm (SMPS) e 300-400 nm (OPC), come mostrato nella tabella 3.
Abb 5
Figura 5: Diametro aerodinamico mediano di massa (MMAD) (203 nm) e deviazione standard geometrica (GSD) (2.01) dell'ossido di grafene aerosolizzato misurato dal MOUDI.

tisch 3

Analisi del carbonio elementare

La CE totale era 0,18 ± 0,20 mg/cm 2 , 1,56 ± 0,54 mg/cm 2 , 3,34 ± 0,71 mg/cm 2 e 7,25 ± 1,14 mg/cm 2 per le camere di controllo, bassa, media e alta concentrazione, rispettivamente (Tabella 4).

tabella 4

Osservazione degli animali, assunzione di mangime ed effetto sul peso del corpo e degli organi

Non sono stati osservati effetti lordi significativi durante l'esposizione. Inoltre, non sono state osservate perdite significative di peso corporeo o cambiamenti nell'assunzione di cibo durante i periodi di esposizione e di recupero ( Tabella S2 e 3 ). Tuttavia, i pesi del polmone destro erano significativamente più alti (P <0,05) per l'alta concentrazione dopo 1 giorno, suggerendo un'ulteriore verifica dell'infiammazione tramite istopatologia e analisi delle cellule e del liquido BAL ( Tabella S4 ).

Istopatologia

Mentre il numero di macrofagi alveolari con l'ossido di grafene ingerito è aumentato in maniera concentrazione-dipendente (Figura 6), un graduale clearance di ossido di grafene è stato osservato durante il periodo di 21 giorni post-esposizione. Indipendentemente da ciò, alcuni macrofagi con grafene ingerito persistevano ancora il giorno 21 del periodo post-esposizione (Figura 6, frecce rosse).

Nessuna osservazione istopatologica significativa è stata notata nell'epitelio delle vie aeree periferiche, nel tessuto interstiziale, nello spazio alveolare o nella vascolarizzazione nel fegato e nei reni. L'osservazione al microscopio ottico non ha rivelato alcuna chiara evidenza di movimento dei macrofagi ingeriti dall'ossido di grafene nei linfonodi adiacenti ai bronchi. Inoltre, non c'era alcuna risposta istopatologica significativa del parenchima polmonare, e anche a basso ingrandimento, una risposta esclusivamente adattativa di clearance macrofagi polmonari è stato notato (Figura 7). L'esame istopatologico del fegato e dei reni non ha rivelato lesioni significative indotte dall'articolo di prova.

Abb 6
Figura 6: Istopatologia polmonare a 1, 3 e 21 giorni. I pannelli sono organizzati come giorno dopo l'esposizione vs. concentrazione. Ingrandimento 400x. Nessuna delle micrografie ha mostrato infiammazione nei bronchioli o nelle regioni perivascolari. Non c'erano proliferazioni di cellule fibrotiche nei tessuti interstiziali. I macrofagi con ossido di grafene ingerito sono stati rilevati in maniera concentrazione-dipendente. Nessun aspetto granulomatoso è stato osservato a varie concentrazioni per tutto il periodo post-esposizione. Le frecce rosse indicano i macrofagi con ossido di grafene ingerito
Abb 7
Figura 7: Istopatologia polmonare dopo 1, 3 e 21 giorni. I pannelli mostrano immagini microscopiche del controllo e dell'alta concentrazione a basso ingrandimento (100x). Nessuna delle immagini microscopiche mostra l'infiammazione nei bronchioli o regioni perivascolari o parenchima polmonare. Le frecce rosse indicano i macrofagi con ossido di grafene ingerito.
Misurazione dei marcatori infiammatori e delle citochine

La conta cellulare differenziale nel BAL non ha mostrato cambiamenti significativi nel numero totale di cellule, macrofagi, linfociti o PMN (tabella 5). Quando i biomarcatori infiammatori del BAL sono stati confrontati con il gruppo di controllo, è stato osservato un aumento significativo di mTP il giorno 3 dopo l'esposizione per il gruppo a bassa concentrazione.

Ancora una volta, rispetto al gruppo di controllo, tutti i gruppi esposti hanno mostrato una diminuzione significativa e costante di mALB in ogni punto temporale dopo l'esposizione, ma nessun cambiamento significativo in BUN o LDH. (Tabella 6). Inoltre, il liquido BAL non ha mostrato cambiamenti significativi nelle citochine IL-1β o TNF-α durante il periodo post-esposizione (Tabella 6).

tabella 5

tabella 6

Effetto sulla coagulazione del sangue

Rispetto al gruppo di controllo, nessuno dei gruppi esposti ha mostrato alcun cambiamento nei marcatori di coagulazione del sangue PT e APTT durante il periodo di 21 giorni post-esposizione (Tabella 7).

tabella 7

Ematologia e biochimica del sangue

La concentrazione di emoglobina corpuscolare media (MCHC) ha mostrato una diminuzione significativa (P < 0,01) nel gruppo a bassa concentrazione dopo 1 giorno ( Tabella S7 ). Inoltre, la MCHC ha mostrato una diminuzione (P <0,05) nei gruppi a media e alta concentrazione dopo 3 giorni, ma un aumento (P <0,05) nel gruppo ad alta concentrazione dopo 21 giorni ( Tabella S8-9 ). Il volume piastrinico medio (MPV) ha mostrato un aumento (P < 0,01) nel gruppo a bassa concentrazione dopo 1 giorno ( Tabella S7 ) .

Anche la percentuale di cellule non colorate (LUC) è aumentata (P <0.01) nel gruppo a bassa concentrazione dopo 1 giorno ed è aumentata (P <0.05) nei gruppi a bassa e media concentrazione dopo 3 giorni (tabella S7-8). Il numero assoluto di grandi cellule non macchiate (abs luc) è aumentato (P < 0.05) nel gruppo a media concentrazione dopo 3 giorni (Tabella S8). Mentre LUC ha mostrato una tendenza coerente di aumenti significativi attraverso tutti i punti di tempo dopo l'esposizione, questi cambiamenti erano tutti all'interno della gamma normale di valori di controllo numerico per questo punto finale.

Il gruppo a media concentrazione ha mostrato livelli di colesterolo (CHO) più bassi rispetto al gruppo a bassa concentrazione (p < 0,05) ( Tabella S10 ). Anche il livello di creatina (CRE) è diminuito (P < 0,05 - 0,01) nei gruppi a media e alta concentrazione dopo 1 giorno (tabella S10). Il fosfato inorganico (IP) è diminuito significativamente (P < 0.05 - 0.01) in tutti i gruppi esposti dopo 1 giorno e nei gruppi a media e alta concentrazione (P < 0.05) dopo 3 giorni ( Tabella S10-11 ). Il livello di lattato deidrogenasi (LDH) è diminuito (P < 0,05) nel gruppo ad alta concentrazione dopo 1 giorno ed è diminuito (P < 0,01) nei gruppi a media e alta concentrazione dopo 3 giorni ( Tabella S10-11). Il gruppo ad alta concentrazione ha anche mostrato un livello di LDH più basso rispetto al gruppo a bassa concentrazione (p < 0,05) (Tabella S10).

Il livello di magnesio (MG) è diminuito (P < 0,01) nei gruppi a media e alta concentrazione dopo 1 giorno e diminuito (P < 0,01) nei gruppi a bassa, media e alta concentrazione dopo 3 giorni . Il gruppo a media e alta concentrazione ha anche mostrato una MG più bassa rispetto al gruppo a bassa concentrazione (P < 0.01) (Tabella S 10-12). Il livello di trigliceridi (TG) è aumentato (p < 0.01) nel gruppo a bassa concentrazione dopo 1 giorno ed è aumentato (P < 0.01) nel gruppo ad alta concentrazione dopo 3 giorni ( Tabella S10-11) . Mentre i livelli di TG hanno mostrato aumenti significativi coerenti attraverso i punti di tempo dopo l'esposizione, questi cambiamenti erano all'interno della gamma normale dei valori di controllo numerico.

Il livello di transaminasi glutammica ossidativa (GOT) è diminuito (P < 0.01) nel gruppo a bassa concentrazione dopo 1 giorno ed è aumentato (P < 0.01) nel gruppo ad alta concentrazione dopo 3 giorni (tabella S11). Il gruppo ad alta concentrazione ha anche mostrato un GOT più basso rispetto al gruppo a bassa concentrazione (p < 0,05) ( Tabella S10 ). Il livello di creatina chinasi (CK) è diminuito nei gruppi a media e alta concentrazione dopo 3 giorni (P < 0,01) (Tabella S11). Il livello di sodio (Na) è diminuito nel gruppo a bassa concentrazione dopo 3 giorni (P < 0.05) (Tabella S11).

I livelli di albumina (ALB) e fosfatasi alcalina (ALP) sono diminuiti nei gruppi a media e bassa concentrazione, rispettivamente, dopo 21 giorni (P < 0.05) (Tabella S12). Il livello di glucosio (GLU) è aumentato nei gruppi a media e alta concentrazione dopo 21 giorni (P <0.01) (Tabella S12). Tuttavia, mentre consistenti aumenti significativi in IP, GOT, LDH, MG, CK sono stati osservati in tutti i punti di tempo dopo l'esposizione, questi cambiamenti erano tutti all'interno della gamma normale di valori di controllo numerico ( Tabella S10-11 ). Di conseguenza, nessun effetto significativo di rilevanza tossicologica sulla funzione ematologica renale ed epatica è stato osservato dopo l'esposizione all'ossido di grafene.

Discussione

I termini "innovazione sicura" e "safe by design" sono attualmente ampiamente utilizzati nel campo delle nanotecnologie per sostenere le considerazioni sulla sicurezza all'inizio del processo di innovazione dei nanomateriali e dei prodotti nanocapaci (Park et al., 2017). I nanomateriali di grafene sono davvero un buon esempio di innovazione sicura o safe-by-design. A causa del forte interesse per lo sviluppo commerciale dei nanomateriali legati al grafene e del crescente trend di produzione, la valutazione dei rischi associati prima dell'inizio della produzione è molto importante. Una recente revisione degli studi di tossicità dei nanomateriali a base di grafene negli animali da laboratorio ha indicato potenziali tossicità comportamentali, riproduttive e di sviluppo e genotossicità ( Ema et al., 2017 ).

Mentre la tossicità acuta per inalazione dell'ossido di grafene è stata descritta come bassa (Han et al, 2015), la tossicità ripetuta per inalazione dell'ossido di grafene non è stata ancora studiata. Pertanto, lo studio attuale, basato sullo studio di inalazione a breve termine di Ma-hock et al (2009), rappresenta un primo passo nella valutazione del pericolo e nella determinazione del range per futuri studi subacuti e subcronici. Di conseguenza, sulla base delle analisi ematologiche e biochimiche dopo l'esposizione all'ossido di grafene e durante un periodo di osservazione post-esposizione, l'attuale studio di inalazione a breve termine non ha rivelato significativi effetti tossici sistemici dell'ossido di grafene.

I risultati hanno anche mostrato una tendenza simile a un precedente studio sull'esposizione subacuta al grafene (Kim et al., 2016). L'esame istopatologico del fegato e dei reni non ha rivelato cambiamenti istopatologici significativi legati all'articolo in esame. Inoltre, non sono state osservate differenze significative nelle cellule del lavaggio broncoalveolare, come linfociti, macrofagi e PMN. Anche la valutazione delle citochine del fluido BAL (cioè IL-1β, TNF-α) non ha mostrato cambiamenti significativi dipendenti dalla concentrazione durante il periodo post-esposizione (Tabella 6).Una risposta spontanea di clearance dei macrofagi alveolari ingeriti dall'ossido di grafene è stata osservata nei polmoni di tutti i gruppi di concentrazione durante i 21 giorni del periodo post-esposizione.

La tabella 8 presenta un confronto dei risultati di tossicità per il grafene e l'ossido di grafene in vari studi di inalazione a breve termine e subacuta con il grafene. Lo studio di inalazione del grafene a breve termine di Shin et al, 2015 e lo studio di inalazione subacuta del grafene di Kim et al, 2016 hanno riportato risultati di tossicità quasi identici allo studio di inalazione acuta dell'ossido di grafene di Han et al, 2015 e all'attuale studio di inalazione dell'ossido di grafene a breve termine. Tuttavia, un altro studio sull'aspirazione faringea di nanoplate di grafene con dimensioni laterali di < 2, 5 e 20 µm ha riscontrato un aumento dei marcatori infiammatori nei fluidi BAL quando sono stati utilizzati nanoplate di grafite più grandi di 5 µm (Roberts et al., 2016).

Questi diversi risultati potrebbero essere dovuti alla distribuzione delle dimensioni laterali del grafene e dell'ossido di grafene. Quando la dimensione laterale era inferiore a 5 µm, i macrofagi alveolari ripresi con grafene e ossido di grafene hanno mostrato risultati simili con una tossicità minima. Tuttavia, quando la dimensione laterale era superiore a 5 μm, il grafene ha indotto una risposta infiammatoria nel fluido BAL dopo l'esposizione (Ma-hock et al., 2013). Negli studi di Shin et al (2015) e Ma-hock et al (2013), gli animali sono stati esposti a un massimo di 3 µg/m 3 e 10 µg/m 3 per inalazione a nanoplasmi di grafene, rispettivamente, e sono stati autorizzati a recuperare per 21 giorni. Mentre gli aerosol di nanoplate di grafene avevano un MMAD simile in ogni studio, le risposte infiammatorie sono state determinate dalle diverse dimensioni laterali dei nanoplate di grafene.

Inoltre, anche i diversi metodi di consegna possono influenzare la risposta infiammatoria. Le tecniche di instillazione intratracheale (Shinwald et al., 2012) o di aspirazione faringea per la consegna ai polmoni di ratti o topi possono comportare una maggiore aggregazione dei nanomateriali e generalmente non riproducono accuratamente i modelli di deposizione osservati con l'esposizione per inalazione a sospensioni secche aerosolizzate o nebulizzate di nanomateriali.

La differenza principale è che l'esposizione in bolo (instillazione o aspirazione) è un modo non fisiologico di consegnare un materiale sospeso in liquido in frazioni di secondo a un tasso di dose molto elevato.mentre l'inalazione fisiologica deposita materiali aerosolizzati per un periodo di tempo più lungo (giorni, settimane o mesi a bassi tassi di dose) (Oberdorster et al., 2015 ). Pertanto, la risposta infiammatoria indotta dopo l'instillazione intratracheale di ossido di grafene e ossido di grafene ridotto nei topi con un aumento della risposta alla fase acuta insieme all'amiloide A nel siero ( Bengston et al., 2017 ) non è stata osservata nello studio di inalazione attuale, che non ha mostrato una risposta infiammatoria marcata.

tabella 8

Sulla base dello studio di inalazione a breve termine degli autori, è stato completato anche uno studio di inalazione subcronica con nanoparticelle di ossido di grafene, e i risultati hanno mostrato che i macrofagi hanno ingerito le particelle a concentrazioni moderate e alte come risposta spontanea alla clearance. Pertanto, il NOAEL proposto per lo studio di inalazione subcronica è stato di 3,02 mg/m 3 e non sono stati identificati organi bersaglio (An et al., 2017).

Le linee guida di prova OCSE recentemente riviste per i test di tossicità per inalazione subacuta e subcronica ora richiedono l'analisi dell'esposizione polmonare per fornire informazioni sulla deposizione polmonare e sulla ritenzione delle particelle nel polmone alla fine dell'esposizione e agli intervalli di osservazione post-esposizione ( OCSE 2017a ; 2017b ). Nello studio attuale, le misurazioni del carbonio elementare (EC) del tessuto polmonare da 1 giorno a 21 giorni sono state utilizzate per fornire informazioni sulla clearance dell'ossido di grafene. Tuttavia, non c'era una tecnologia disponibile per analizzare l'EC dal tessuto polmonare. Questa tecnologia è stata sviluppata dagli autori attuali e sarà utilizzata nei nostri futuri studi di inalazione di nanomateriali di carbonio.

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