Esiste un brevetto per il vaccino Co-Delivery?


Brevetto: Preparazione e applicazione di pachyman nano adiuvante e vaccino co-delivery adiuvante/antigene basato su ossido di grafene, appartenente al campo dei farmaci.

Descrizione

L'invenzione comprende un nano adiuvante di pachyman che è formato prendendo un materiale nano dell'ossido di grafene come trasportatore e pachyman caricato sul trasportatore e un vaccino di co-delivery dell'adiuvante/antigene formato dall'adiuvante e da un antigene.

 

L'adiuvante pachyman nanometro può promuovere la maturazione delle cellule dendritiche, migliorare la funzione dei linfociti, facilitare il rilascio del farmaco, prolungare efficacemente l'effetto del farmaco, prevenire la tolleranza immunitaria e migliorare notevolmente l'effetto immunitario e il tempo di reazione.

Il vaccino di co-delivery adiuvante/antigene migliora la biodisponibilità del pachyman e dell'antigene, permette all'antigene e all'adiuvante di essere ingeriti dalla stessa cellula, migliora notevolmente la proprietà di targeting del vaccino, e può indurre non solo l'immunità umorale ma anche una più forte immunità cellulare. L'invenzione è usata come un nuovo adiuvante e vaccino, e ci si può aspettare che venga usata per prevenire e trattare le malattie umane.

Campo tecnico

L'invenzione appartiene al campo dei farmaci e in particolare riguarda un nano adiuvante pachyman basato su un materiale di ossido di grafene e un metodo di preparazione e applicazione di un vaccino di co-delivery adiuvante/antigene formato dal nano adiuvante pachyman e un antigene.

Sfondo

Lo sviluppo e l'applicazione dei vaccini sono stati ampliati dalla prevenzione delle malattie al trattamento di molte malattie non infettive, e i tradizionali vaccini vivi attenuati hanno generalmente un'alta immunogenicità, ma il rischio di mutazione posteriore, e l'effetto immunitario ha alcune limitazioni. I vaccini inattivati, i vaccini a subunità, i vaccini a DNA e i vaccini ricombinanti sono relativamente sicuri, ma hanno un'immunogenicità limitata, e possono esercitare effetti protettivi efficaci a lungo termine se integrati con adiuvanti.

L'immunoadiuvante, come immunopotenziatore aspecifico, può aumentare significativamente l'effetto immunologico o cambiare il tipo di risposta immunitaria dopo la vaccinazione essendo iniettato nel corpo in anticipo o contemporaneamente ad un antigene. Da quando l'adiuvante di alluminio è stato approvato nel 20° secolo, è diventato l'adiuvante più usato, e può migliorare l'immunità primaria, ridurre la dose di antigene e la frequenza di immunizzazione, ma non può indurre la risposta CTL, e può causare varie reazioni avverse.

Con un lento progresso di decenni, l'emulsione olio-in-acqua MF59 è stata approvata per la commercializzazione alla fine degli anni '90 del 20° secolo, e gli adiuvanti AS03, AS01, AS04 e CpG ODN sono stati approvati in sequenza dal 21° secolo. Oltre ai pochi adiuvanti per vaccini menzionati sopra, che sono approvati per l'uso umano, la maggior parte di essi sono ancora in fase di sperimentazione clinica o preclinica, e il numero di adiuvanti disponibili per l'uso umano è molto limitato, così che lo sviluppo di nuovi adiuvanti è urgentemente necessario.

Tuckahoe (Poria cos (Schw.) Wolf) è una medicina tradizionale cinese di lunga data ed è ampiamente applicata al trattamento delle medicine tradizionali cinesi. Poria cocos (Schw.) Wolf delle Polyporaceae, funghi Polyporus, ha sclerotium secco, che cresce principalmente sulla radice del pino. I principi attivi comprendono principalmente: polisaccaridi, alcaloidi, saponine, terpeni, polifenoli, ecc.

I polisaccaridi sono i componenti principali di Poria cocos, e il pachyman è una miscela di diversi tipi di polisaccaridi estratti e purificati da Poria cocos, e il suo contenuto è circa 84% di sclerozio secco di Poria cocos, e comprende polisaccaridi solubili in acqua e polisaccaridi solubili in alcali, ed è composto da glucosio, fucosio, arabinosio, xilosio, mannosio e galattosio.

Un gran numero di ricerche dimostra che il pachyman ha gli effetti di migliorare l'immunità, proteggere gli organi immunitari degli organismi, migliorare le funzioni delle cellule T e B, influenzare l'attività delle cellule dendritiche e influenzare il rilascio di alcune citochine, promuovendo così la risposta immunitaria specifica e non specifica. E la bassa tossicità e i minori effetti collaterali del pachyman lo rendono un adiuvante immunologico ideale. Tuttavia, il peso molecolare di pachyman è grande, e il rilascio del farmaco è troppo veloce, che può causare un dosaggio di iniezione troppo grande, aumentando così la difficoltà di applicazione clinica di pachyman. Pertanto, è urgente risolvere questo problema.

I nanomateriali si riferiscono a cristalli singoli o corpi policristallini con granulometria inferiore a 100 nm. Le nanoparticelle hanno le caratteristiche biologiche di essere facilmente assorbite da varie cellule, e possono essere fagocitate dalle cellule che presentano l'antigene, in modo che la risposta immunitaria causata dagli antigeni sia potenziata. Il nano materiale può anche rilasciare lentamente l'antigene, ridurre il dosaggio o i tempi dell'antigene, aumentare la dimensione dell'antigene di piccole molecole, e trattare completamente l'antigene, in modo che l'effetto immunitario sia più duraturo.

Alcune nanoparticelle stesse hanno un effetto stimolante sul sistema immunitario e l'immunizzazione con vaccini contenenti nanomateriali può provocare una risposta immunitaria nelle mucose e nella mucosa gastrointestinale. Il grafene è un nanomateriale di carbonio con una struttura bidimensionale piana, e la speciale struttura a strati monoatomici del grafene permette al grafene di avere una pluralità di proprietà fisico-chimiche uniche.

L'ossido di grafene è un ossido di grafene, e poiché l'ossido di grafene contiene più gruppi funzionali contenenti ossigeno dopo l'ossidazione, le proprietà dell'ossido di grafene possono essere migliorate da varie reazioni con i gruppi funzionali contenenti ossigeno. L'ossido di grafene e i suoi derivati presentano i vantaggi di un'elevata area superficiale specifica, una forte conducibilità elettrica e termica, una buona biocompatibilità e simili, e sono ampiamente applicati ai campi biomedici dei trasportatori di farmaci, della rilevazione e del trattamento del cancro e simili.

Pertanto, è necessario selezionare il pachyman come materia prima, viene adottato un metodo di rivestimento in ossido di grafene, il farmaco viene rilasciato lentamente, il dosaggio del pachyman viene ridotto, e viene trovato un immunopotenziatore efficace, sicuro e stabile, ovvero il nano adiuvante pachyman basato sul materiale in ossido di grafene.

Divulgazione dell'invenzione

L'invenzione fornisce un adiuvante nano di pachyman e un vaccino co-delivery adiuvante/antigene formato dall'adiuvante. Il nano adiuvante del pachyman può notevolmente aumentare l'effetto immunitario dei vaccini, ridurre il dosaggio del pachyman, ridurre il dosaggio degli antigeni del vaccino dopo che gli antigeni sono incapsulati e risolvere vari problemi limitati nell'applicazione clinica nell'arte precedente.

L'invenzione fornisce anche un nano adiuvante pachyman e un metodo di preparazione del vaccino co-delivery adiuvante/antigene formato dall'adiuvante, e il metodo di preparazione è semplice e facile da usare, ha effetto ovvio ed è adatto alla produzione su larga scala.

Per raggiungere lo scopo, l'invenzione adotta il seguente schema tecnico:

L'invenzione fornisce un adiuvante nano del pachyman, in cui un materiale dell'elemento portante dell'adiuvante nano del pachyman è ossido nano del grafene e il pachyman è collegato ad un elemento portante nano dell'ossido del grafene per formare l'adiuvante nano del pachyman basato su un materiale dell'ossido del grafene. Il nano adiuvante di pachyman fornito dall'invenzione può caricare il pachyman con alta efficienza e risolve i problemi di applicazione clinica del rilascio rapido della medicina di pachyman e del dosaggio di iniezione overlarge.

Il nano ossido di grafene è un ossido di grafene trattato con un metodo nano, ha più gruppi funzionali contenenti ossigeno, ed è un nano materiale con alta area superficiale specifica e buona biocompatibilità. La dimensione delle particelle è di 1-100 nm, il peso molecolare è di 5-10 kDa, il vettore può entrare nei linfonodi per agire, e il vettore è ampiamente applicato al campo dei vettori di farmaci e vaccini.

Il peso molecolare del pachyman è 8-15 kDa, i monosaccaridi costituzionali del pachyman comprendono glucosio, mannosio, fucosio, galattosio e simili, e il rapporto di massa dei monosaccaridi costituzionali è (2-3,5): (1-2): (0.3-4): 1.

Il rapporto di massa dell'ossido di grafene nano al pachyman è 1: 2,5-1: 10, preferibilmente 1: 5.

la dimensione preferita delle particelle dell'adiuvante pachyman nanometro è 100-500 nm e il peso molecolare è 15-45 kDa.

Un metodo per la preparazione del coadiuvante pachyman nanometrico comprende i seguenti passi:

(1) sciogliendo e disperdendo l'ossido di grafene utilizzando acqua sterile, effettuando il trattamento ultrasonico per 2 ore, effettuando il trattamento ultrasonico del bagno di ghiaccio per 30 minuti, aggiungendo l'idrossido di sodio (la concentrazione finale è 5M), e continuando il trattamento ultrasonico per 2 ore; centrifugando ad una velocità elevata da 16.000g di supergravità, e raccogliendo il surnatante per ottenere una soluzione portante dell'ossido di grafene nano, dove la concentrazione finale della soluzione portante dell'ossido di grafene nano è 0.1-10 mg/mL, e preferibilmente 1 mg/mL;

(2) e (3) effettuando il trattamento ultrasonico sulla soluzione di ossido di grafene nano nel passo (1) per 1 ora, e regolando il pH a 9-10, preferibilmente 9,5. Aggiungendo cloropropano epossidico, introducendo azoto per la reazione, mescolando e reagendo per 4 ore alla temperatura di 40 ℃ a bagnomaria, e dializzando per rimuovere cloropropano epossidico non reagito;

(3) preparando la soluzione di pachymaran con acqua deionizzata, ed eseguendo il trattamento di cromatografia di affinità per rimuovere l'endotossina, dove il contenuto di endotossina è inferiore a 5EU/mL, e la concentrazione della soluzione di pachymaran è 2-20 mg/mL, preferibilmente 5 mg/mL.

(4) E (3) sciogliendo la soluzione di pachymaran nella soluzione dell'ossido di grafene nano nel punto (2), regolando il pH a 9-10, preferibilmente 9, effettuando il bagno d'acqua a 42 ℃ per 1-3 ore, preferibilmente 3 ore e centrifugando e raccogliendo per ottenere l'adiuvante nano di pachymaran che porta l'ossido di grafene nano.

Il coadiuvante pachymaran preparato da uno qualsiasi dei metodi di preparazione è anche nell'ambito della protezione dell'invenzione.

L'invenzione fornisce anche un vaccino co-delivery adiuvante/antigene, che viene preparato caricando il nano adiuvante pachyman con un antigene del virus. L'antigene e il pachyman del vaccino co-delivery adiuvante/antigene sono entrambi collegati con l'ossido di grafene. La dimensione delle particelle del vaccino è di 50 nm-1000 nm, e il valore assoluto del potenziale zeta è di 20-30 mv.

Gli antigeni virali includono: l'antigene del virus è uno qualsiasi dei virus inattivati EV71, virus inattivato dell'epatite A, virus inattivato della polio, virus inattivato dell'influenza, particelle simili al virus HPV, particelle simili al virus dell'epatite B o proteine ricombinanti contenenti gli antigeni del virus.

Il rapporto di massa dell'ossido di grafene nano al pachyman è 1: 2,5-1: 10, e preferibilmente 1: 5.

Il rapporto di massa dell'antigene del virus al pachyman è 1: 2-1: 50, e preferibilmente 1: 25.

Nell'invenzione, il metodo di preparazione del vaccino co-delivery adiuvante/antigene comprende le seguenti fasi:

(1) sciogliendo l'ossido di grafene in acqua sterile, effettuando il trattamento ultrasonico per 2 ore, effettuando il trattamento ultrasonico del bagno di ghiaccio per 30 minuti, aggiungendo la base forte, effettuando il trattamento ultrasonico continuo per 2 ore, effettuando la centrifugazione ad alta velocità ad una ipergravità di 16.000g e raccogliendo il surnatante per ottenere una soluzione portante dell'ossido di grafene nano, in cui la concentrazione finale della soluzione portante dell'ossido di grafene nano è 0,1-10 mg/mL. Preferibilmente 1 mg/mL.

(2) effettuando il trattamento ultrasonico sulla soluzione dell'ossido di grafene nano nel punto (1) per 1 ora, regolando il valore di pH a 9-10, preferibilmente 9.5, aggiungendo cloropropano epossidico, introducendo l'azoto per la reazione, mescolando e reagendo alla temperatura di 40 ℃ in un bagno di acqua per 4 ore e dializzando per rimuovere cloropropano epossidico non reagito;

(3) preparando la soluzione di pachyman con acqua deionizzata, ed eseguendo il trattamento di rimozione dell'endotossina, dove la concentrazione della soluzione di pachyman è 2-20 mg/mL, e preferibilmente 5 mg/mL.

(4) e (3) sciogliendo la soluzione di pachymaran nel punto (3) nella soluzione dell'ossido di grafene nano nel punto (2), regolando il pH a 9-10, preferibilmente 9, effettuando il bagno d'acqua a 42 ℃ per 1-3 ore, preferibilmente 3 ore e centrifugando e raccogliendo per ottenere l'adiuvante nano di pachymaran rivestito di ossido di grafene nano.

(5) Regolazione del pH della soluzione nano adiuvante pachyman che trasporta l'ossido di grafene nano nel passo (4) a 4.5-7.2, preferibilmente 6; aggiunta di EDC e Sulfo-NHS, e miscelazione per 15 min-1 h, preferibilmente 30 min; regolazione del valore di pH a 7-8, preferibilmente 7.2, aggiunta di una soluzione di antigene del virus, miscelazione per 1-5 h, preferibilmente 2h, desalinizzazione da una colonna di desalinizzazione per ottenere un vaccino co-delivery adiuvante/antigene;

nella fase (4), il rapporto molare EDC/Sulfo-NHS è 1: 2-10: 1, preferibilmente 4: 1. Il rapporto di concentrazione EDC/ossido di grafene è 1: 5-1: 20, preferibilmente 1: 10.

nella fase (4), la concentrazione della soluzione di antigene del virus è 0,1-20 mg/mL, preferibilmente 1 mg/mL.

L'uso del vaccino di co-delivery antigene/adiuvante descritto sopra nella preparazione di un medicinale è anche nell'ambito della presente invenzione. Per l'uso nel campo dei vaccini profilattici e terapeutici.

Le materie prime del kit utilizzato dall'invenzione sono disponibili in commercio; per i dispositivi, le condizioni (temperatura, tempo, ecc.), le sostanze, le quantità, i metodi, ecc. che non sono specificamente descritti nella presente invenzione, si può utilizzare uno qualsiasi di quelli noti nell'arte o quelli ordinariamente esperti nell'arte per determinare gli stessi.

Rispetto all'arte precedente, l'invenzione presenta i seguenti vantaggi:

1. La preparazione dell'adiuvante nano di pachyman non è segnalata nel paese ed all'estero e l'invenzione fornisce un metodo della preparazione dell'adiuvante nano di pachyman basato su un materiale dell'ossido del grafene e sulle circostanze ottimizzate di ciò.

2. L'attività di immunopotenziamento dell'adiuvante pachymaran nanometro non è riportata. L'implementazione dell'invenzione dimostra che l'effetto immunitario è notevolmente migliorato dopo che il pachyman è preparato nel nano adiuvante pachyman, che si esprime stimolando le cellule dendritiche dei topi a maturare in vitro e inducendo la risposta immunitaria di tipo TH1. Pertanto, il nano adiuvante pachyman fornisce materiali e dimostrazione per lo sviluppo di nuovi adiuvanti.

3. Il vaccino di co-consegna dell'adiuvante/antigene che contiene l'adiuvante nano del pachyman fornito dall'invenzione ha un'alta stabilità, migliora notevolmente la biodisponibilità del pachyman e dell'antigene, permette che l'antigene e l'adiuvante siano presi dalla stessa cellula, migliora la proprietà di targeting del vaccino, può migliorare la risposta immunitaria di tipo TH1 ed ha i vantaggi di forte persistenza della risposta immunitaria, buon effetto immunitario, maggiore secrezione di citochine e simili.

Disegni

Figura 1: mostra il processo di preparazione del nano adiuvante pachyman e del vaccino co-delivery antigene adiuvante.

Figura 2: mostra il potenziale Zeta di pachyman nano adiuvante.

Fig. 1,2

 

FIG. 3: mostra la microscopia elettronica del nanoadiuvante pachyman.

Figura 4: mostra che il vaccino nano-adiuvante pachyman è stato assorbito dalle cellule dendritiche.

Fig. 3
Fig. 4

 

Figura 5: mostra che il vaccino nano-adiuvante pachyman ha indotto i BMDC ad aumentare l'espressione di CD86.

Fig. 5

 

Figura 6: mostra che il vaccino nano-adiuvante pachyman ha indotto il BMDC ad aumentare l'espressione di CD80.

Figura 7: mostra che il vaccino nano-adiuvante pachyman ha indotto i BMDC a up-regolare l'espressione MHCII.

Fig. 6, 7

 

Figura 8: mostra che il vaccino nano-adiuvante pachyman ha indotto la produzione di anticorpi IgG specifici all'antigene dopo l'immunizzazione dei topi.

FIG. 9: mostra che il vaccino con adiuvante nanometrico Pachymaran induce le cellule della milza a secernere citochine IFN-gamma dopo che i topi sono stati immunizzati.

Fg. 8, 9

 

FIG. 10: mostra che la secrezione di citochine IL-4 da parte degli splenociti è stata indotta dopo l'immunizzazione dei topi con il vaccino adiuvante Pachymaran nanometro.

Fig. 10

 

Descrizione dettagliata

La presente invenzione è ulteriormente illustrata dai seguenti esempi, che includono, ma non sono limitati a, i seguenti esempi.

Le procedure sperimentali utilizzate nei seguenti esempi sono tutte procedure convenzionali, se non diversamente specificato.

Materiali, reagenti e simili utilizzati nei seguenti esempi sono disponibili in commercio se non diversamente specificato.

Esempio 1

L'incarnazione è un processo di preparazione del nano adiuvante pachyman basato sul materiale dell'ossido di grafene e il vaccino di co-delivery adiuvante/antigene formato dall'adiuvante.

Il metodo di preparazione comprende le seguenti fasi:

(1) sciogliendo l'ossido di grafene in acqua sterile, effettuando il trattamento ad ultrasuoni per 2 ore, effettuando il trattamento ad ultrasuoni a bagno di ghiaccio per 30 minuti, aggiungendo una base forte, ed effettuando il trattamento ad ultrasuoni per 2 ore. Centrifugare ad un'alta velocità di 16.000g, e raccogliere il surnatante per ottenere una soluzione portante di nano ossido di grafene con una concentrazione finale di 1 mg/mL.

(2) E (2) effettuando il trattamento ultrasonico sulla soluzione dell'ossido di grafene nano nel punto (1) per 1 ora, regolando il valore di pH a 9.5, aggiungendo cloropropano epossidico, introducendo l'azoto per la reazione, mescolando in un bagno di acqua a 40 ℃ per la reazione per 4 ore, e dializzando per rimuovere il cloropropano epossidico non reagito.

(3) Preparare la soluzione di pachyman con acqua deionizzata e rimuovere l'endotossina per ottenere una soluzione di pachyman con una concentrazione di 5 mg/mL.

(4) E (3) sciogliendo la soluzione di pachymaran nel passo (3) nella soluzione di ossido di grafene nano nel passo (2), regolando il valore di pH a 9, effettuando il bagno d'acqua a 42 ℃ per 3 ore, ed effettuando la raccolta centrifuga per ottenere il nano adiuvante di pachymaran rivestito di ossido di grafene nano.

(5) E (4) regolando il pH della soluzione pachyman nanometro adiuvante portando l'ossido di grafene nanometro nel passo (4) a 6. EDC di legatura e Sulfo-NHS sono stati aggiunti e mescolati per 30 min. Regolazione del pH a 7, aggiunta di una soluzione di antigene del virus, miscelazione per 2 ore, desalinizzazione con una colonna di desalinizzazione per ottenere un vaccino co-delivery adiuvante/antigene;

il metodo per la preparazione del portatore di ossido di grafene vuoto è lo stesso del precedente, tranne che il pachyman e l'antigene non vengono aggiunti.

Esempio 2

Lo schema di costruzione del vaccino co-delivery adiuvante/antigene basato sul nano adiuvante pachyman è mostrato nella figura 1,

esempio 2 caratterizzazione dell'adiuvante/antigene Vaccini co-consegnati con adiuvante Pachymaran Nano

(1) Misurazione del potenziale Zeta di superficie

Le soluzioni del campione di vaccino coadiuvante/antigene Pachymaran nano sono state preparate con precisione a una concentrazione di 0,1mg/mL usando acqua ultrapura Milli-Q. 1mL della soluzione campione è stato utilizzato per determinare il potenziale Zeta di superficie delle nanoparticelle utilizzando un analizzatore di potenziale Zeta (Malvern, UK, Zetasizer NanoZS). La temperatura è mantenuta per 20min prima di ogni rilevamento, ogni campione è testato per tre volte, il risultato è mediato, il risultato è mostrato in figura 2, e il valore assoluto del potenziale zeta è più di 20Mv, il che indica che il campione è relativamente stabile.

(2) Osservazione al microscopio elettronico a trasmissione

Una soluzione di campione di vaccino coadiuvante/antigene pachyman con la concentrazione di 0.1mg/mL viene preparata con precisione con acqua ultrapura Milli-Q, 10-20 mu L della soluzione del campione vengono gocciolati su una rete di rame a 230 maglie contenente un film di supporto in carbonio, e dopo l'essiccazione a temperatura costante, la morfologia del campione viene osservata con un microscopio elettronico a trasmissione (TEM, FEI in USA, Tecnai G220S-TWIN, 200kV) (figura 3).

(3) Studi sulla stabilità del vaccino co-delivery adiuvante/antigene

Il potenziale Zeta di un vaccino co-consegnato adiuvante/antigene contenente una quantità adeguata di nano adiuvante pachyman è misurato da un dimensionatore di particelle laser, lo stesso lotto di vaccino co-consegnato adiuvante/antigene è preso dopo due settimane, il potenziale Zeta è misurato con lo stesso metodo, nessuna differenza evidente esiste, e il vaccino co-consegnato adiuvante/antigene rivelato dall'invenzione è buono nella stabilità.

(4) Consegna del farmaco in vitro

Prendendo una quantità adeguata di adiuvante/antigene co-delivery vaccino contenente pachyman nano adiuvante, in cui un modo antigene OVA è segnato da FITC e poi viene aggiunto in DC2.4 cellule dendritiche di topo, dopo la coltura per 6h, le cellule sono fissate, DAPI è adottato per macchiare i nuclei delle cellule, la fluorescenza è osservata sotto un microscopio a fluorescenza, come mostrato nella figura 4, l'espressione di fluorescenza verde è vista fuori dai nuclei delle cellule, parte delle cellule dendritiche prendono l'antigene, e il sistema di co-delivery adiuvante/antigene può portare l'antigene nelle cellule.

(5) Misura del carico di droga

Prendendo una quantità adeguata di adiuvante/antigene co-delivery vaccino contenente pachyman nano adiuvante, e misurando la capacità di carico della proteina antigene utilizzando un metodo BCA, dove la concentrazione di carico della proteina antigene è 0.5mg/mL, e la capacità di carico del farmaco è buona.

Esempio 3

(a) Il vaccino co-delivery adiuvante/antigene preparato nell'esempio 1, pachyman, nano vettore di ossido di grafene vuoto preparato nell'esempio 1, antigene modello e gruppo soluzione PBS sono stati utilizzati come controllo negativo (PBS) per trattare le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo del topo (BMDC), e l'effetto del controllo negativo sulla maturazione delle cellule dendritiche del topo in vitro è stato esplorato come segue:

Topi C57/BL6 di grado SPF, femmina, sono stati selezionati per 6-8 settimane.

(1) Preparazione di cellule di midollo osseo

Uccidere un topo utilizzando un metodo di dislocazione cervicale, tosando la pelle e i capelli del topo, prendendo il femore, immergendolo in alcool 70% per 2-5 minuti, trasferendolo in un terreno di coltura di siero intero RPMI1640 (in ghiaccio), tosando attentamente due estremità del femore, succhiando 100-200 mu L di RPMI1640 utilizzando una siringa ogni volta, e lavando ripetutamente il midollo osseo in una provetta sterile contenente il RPMI1640 finché l'osso è completamente sbiancato. Il lavaggio del midollo osseo è stato trasferito dalla provetta a una capsula di Petri contenente RPMI1640 siero intero per filtrazione attraverso una rete di nylon a 200 mesh. Coltivazione in scatola di coltura cellulare per 30 minuti. La conta delle cellule non aderenti o vagamente aderenti è stata raccolta, regolata a 1X106 cellule/mL, sono stati aggiunti 20ng/mL di GM-CSF e piastrati.

(2) Cultura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo

Il giorno successivo di coltura delle cellule del midollo osseo, il liquido è stato parzialmente cambiato ed è stato aggiunto un nuovo mezzo di siero intero RPMI1640 contenente GM-CSF. Il terzo giorno, la soluzione è stata completamente cambiata, il surnatante cellulare è stato aspirato, le cellule non aderenti sono state lavate via delicatamente, e un nuovo mezzo di siero intero RPMI1640 contenente GM-CSF è stato aggiunto ad ogni pozzetto. Il quarto o il quinto giorno, le cellule non aderenti o vagamente aderenti sono state raccolte mediante lavaggio e le cellule aderenti sono state scartate. Il sesto o il settimo giorno, dopo 48 ore di cultura, le BMDC immature sono state raccolte per i successivi test.

(3) Citometria a flusso per la determinazione della superficie cellulare CD80 e CD86, MHCII

I BMDC immaturi sono stati raccolti e seminati ad una concentrazione cellulare di 1X 106/mL in piastre da 24 pozzetti. Rispettivamente l'aggiunta di pachymaran, adiuvante / antigene co-delivery vaccino, vettore di ossido di grafene, antigene modello e PBS, trattando per 24 ore, raccogliendo le cellule incompletamente attaccato, sigillando per 30 minuti utilizzando anti-topo CD16/32 anticorpo, aggiungendo APC anti-mouse CD80, PE / Cy7 anti-mouse CD86 e PE anti-mouse MHC II anticorpo, e colorazione per 30 minuti a 1h a 4 ℃ in luogo buio. E raccogliendo le cellule, e rilevando da un citometro a flusso.

I risultati sperimentali sono mostrati in fig. 5-7, il vettore ossido di grafene non ha alcuna influenza significativa sull'espressione delle molecole marcatore di superficie BMDC, e pachyman può significativamente up-regolare le molecole CD86 e MHCII sulla superficie BMDC. I vaccini co-consegnati con adiuvante/antigene possono effettivamente indurre la maturazione dei BMDC in vitro.

Esempio 4

(a) Il vaccino co-consegnato adiuvante/antigene preparato nell'esempio 1, il pachyman, l'antigene modello e il gruppo della soluzione PBS sono stati usati come controllo negativo (PBS in breve) per immunizzare i topi, e l'influenza del controllo negativo sull'immunità cellulare del topo e l'immunità umorale in vivo è stata esplorata, come segue:

I topi c57BL/6 (femmina, 6-8w) sono stati immunizzati per via sottocutanea il giorno D0, e ogni gruppo è stato vaccinato con PBS, antigene modello (10 μ g), pachyman (500 μ g) o un vaccino co-consegnato contenente 10mg di antigene modello. Il sangue viene prelevato dopo 2 settimane per la conservazione, l'immunizzazione di rinforzo viene effettuata una volta, i topi vengono sacrificati dopo 4 settimane, e il sangue viene prelevato per rilevare l'antigene IgG specifico dell'antigene modello OVA del siero dei topi rispettivamente.

La milza viene prelevata e macinata da uno schermo per cellule da 70 m e lavata con PBS/EDTA per preparare la sospensione di singole cellule della milza. Dopo aver contato le cellule, aggiungendo le cellule in una piastra a 96 pozzetti secondo 2 × 105/pozzetti, aggiungendo 300 μ g/mL di soluzione di antigene modello, continuando la coltura per 72 ore, raccogliendo il surnatante delle cellule, e rilevando il contenuto di IFN-gamma e IL-4 citochine nel surnatante delle cellule da ELISA.

Come mostrato nella figura 8, il vaccino co-consegnato con adiuvante/antigene ha aumentato significativamente l'espressione degli anticorpi IgG specifici per l'antigene pattern nel siero del topo rispetto al gruppo di controllo, indicando che l'immunità umorale potrebbe essere promossa.

Il vaccino co-consegnato con adiuvante/antigene ha aumentato significativamente la secrezione di IFN- γ da parte degli splenociti di topo rispetto al gruppo di controllo, indicando che le risposte immunitarie cellulari potrebbero essere migliorate (fig. 9-10).

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