Quelle est la toxicité des nanoparticules d'oxyde de graphène ?


Les nanomatériaux manufacturés à base de carbone, tels que les nanoparticules d'oxyde de graphène (NP de GO), sont largement disponibles pour des applications, mais leurs effets potentiellement néfastes sur la santé humaine doivent encore être étudiés.

Recherche avec le nématode et le graphène oxyde

Dans cette étude, les niveaux environnementaux des NP de GO sont abordés afin d'examiner si le GO entraîne des effets néfastes sur un modèle in-vivo de Caenorhabditis elegans (C. elegans). Des nématodes ayant subi une exposition prolongée (de la larve L1 au jeune adulte) à des NP de GO à 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 mg L-1 ont été utilisés pour évaluer les effets toxiques potentiels, y compris la létalité (toxicité aiguë), les réponses reproductives (taille de la couvée) et neurologiques (locomotion, y compris le mouvement de la tête et la flexion du corps), la longévité (durée de vie) et le stress oxydatif (expression génétique de sod-1, sod-3 et clt-2).

L'exposition prolongée aux NP de GO n'a pas induit de létalité aux niveaux sélectifs. Dans les tests de taille de couvain et d'écrasement de la tête, les réponses biologiques des nématodes ont été significativement réduites à l'exposition aux NP de GO à 0,0100-1,00 ng L-1 par rapport au contrôle non traité. Les nématodes exposés aux NP de GO à 0,00100-1,00 ng L-1 ont présenté des retards significatifs dans le comportement de flexion du corps par rapport au contrôle. Lors de l'examen de la longévité des nématodes, il a été constaté que la durée de vie de tous les vers exposés aux NP de GO était significativement réduite par rapport aux vers non traités. L'expression des gènes sod-1, sod-3 et ctl-2 présentait des plis d'induction significativement plus élevés chez les vers exposés que chez les témoins. Par conséquent, l'exposition prolongée à de faibles doses de NP de GO pourrait être associée à une perturbation de la reproduction et de la locomotion, à une atténuation de la longévité et à l'induction d'un stress oxydatif chez les nématodes.

Introduction

Les nanoparticules d'oxyde de graphène (NPs GO), l'un des dérivés les plus prometteurs du graphène, comprennent un nanomatériau manufacturé (ENM) monocouche avec des groupes fonctionnels à forte teneur en oxygène tels que carboxyle, époxy, carbonyle et hydroxyle (Bianco et al., 2013 ; Li et al., 2015). L'oxyde de graphène (GO) est connu pour son excellente dispersibilité dans de nombreux solvants, sa réactivité chimique et sa capacité de fonctionnalisation chimique (Konios et al., 2014 ; De Marchi et al., 2018). La capacité d'adsorption des NP de GO a été mise à profit pour des applications de remédiation environnementale, comme dans les membranes à base de GO, qui éliminent les contaminants gazeux tels que le dioxyde de soufre et le sulfure d'hydrogène (Fakhri, 2017). En outre, ils agissent également comme des adsorbants pour l'élimination de divers contaminants aqueux en raison de leur teneur élevée en groupes oxygénés fonctionnalisés disponibles pour interagir avec les ions métalliques (Li et al., 2019).

En outre, les nanoparticules de GO peuvent être appliquées à la nanoélectronique, à la catalyse, aux nanocomposites, à la technologie des capteurs, à la purification et au dessalement de l'eau et à l'administration de médicaments (Zhang et al., 2011 ; Pan et al., 2012 ; Giust et al., 2018 ; Prasad et al., 2020). Selon les études de Yang et al. (2015) et Maharubin et al. (2016), le GO peut être utilisé pour le stockage de l'hydrogène (anode, cathode et batteries lithium-soufre) et la gestion des supercondensateurs. En outre, les composites de GO sont utilisés comme agents antimicrobiens pour la désinfection de l'eau afin d'éliminer les molécules organiques et les agents pathogènes d'origine hydrique (Upadhyay et al., 2014). Plusieurs études ont utilisé les niveaux environnementaux de µg L-1 à mg L-1 de contamination par des NP de GO pour tester les modèles in-vivo (He et al., 2017 ; Zhang et al., 2017 ; Li et al., 2019).

Le marché mondial des produits à base de graphène, comme le GO, est en augmentation. La demande devrait s'élever à $675 et 987 millions d'ici 2020 et 2022, respectivement (Ahmed et Rodrigues, 2013). En raison de leur potentiel à la fois pour la production et l'application, les matériaux GO devraient être libérés dans l'environnement au cours de leur cycle de vie et finalement être générés dans les décharges et les stations de traitement des eaux usées (Du et al., 2017 ; Suárez-Iglesias et al., 2017 ; Jamialahmadi et al., 2018). Le GO peut être libéré dans l'environnement aquatique grâce au développement de ses composites en tant qu'adsorbants pour la contamination aqueuse, membranes pour la filtration et la purification de l'eau, et catalyseurs pour la décontamination environnementale (Zhao et al., 2014 ; Goodwin et al., 2018).

Plusieurs études ont signalé que la dispersion et le long temps de rétention du GO au sein des communautés microbiennes peuvent entraîner de graves effets négatifs sur la flore microbienne des eaux usées en raison de son hydrophilie (Lyon et Alvarez, 2008 ; Kang et al., 2009 ; Rodrigues et Elimelech, 2010). Les concentrations environnementales prédites de GO peuvent être corrélées à celles des nanotubes de carbone multiparois car les deux ont des propriétés relativement similaires, telles que la taille nanométrique, une structure à base de carbone et des applications dans les dispositifs électroniques grand public (Zhang et al., 2017).

Peu d'études épidémiologiques ont porté sur l'exposition humaine au GO, en particulier pour la population fortement exposée. Pour les modèles in-vivo incluant les rats, les souris, les poissons zèbres, les nématodes et les daphnies, les animaux pourraient induire une nanotoxicité incluant une toxicité aiguë, développementale, neurologique, reproductive, immunologique et neurocomportementale ainsi qu'une longévité réduite après avoir été exposés aux NP de GO (Sanchez et al, 2012 ; Patlolla et al., 2017 ; Qu et al., 2017 ; Souza et al., 2017 ; Kim et al., 2018 ; Qu et al., 2019 ; Kim et al., 2020). Ces dernières années, les effets toxiques in vivo et in vitro des NP de GO, notamment l'immunotoxicité, l'activation de l'inflammation, l'induction d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), la génération de stress oxydatif, l'apoptose, et les mécanismes potentiels d'exposition aux GO ont été étudiés (Guo et Mei, 2014 ; Bengtson et al., 2017 ; Pelin et al., 2018 ; Tang et al., 2018).

L'accumulation de GO dans le cytoplasme provoque des altérations morphologiques spectaculaires et réduit la capacité du récepteur TLR4 (toll-like receptor 4) pour la phagocytose (Qu et al., 2013a). Cependant, une augmentation des ROS intracellulaires contribue à la mort cellulaire nécrotique dans les macrophages (Qu et al., 2013a). Des études précédentes ont également rapporté que GO favorise l'inhibition de la croissance cellulaire, le retard d'éclosion, la génération de ROS et endommage le système circulatoire des embryons de poisson zèbre (Liu et al., 2014 ; Chen et al., 2016 ; Souza et al., 2017). Chez les souris, le GO peut s'accumuler dans des organes tels que le foie, les poumons, la rate et les reins, ce qui peut induire une toxicité pour l'organisme par le biais d'un stress oxydatif intracellulaire causé par l'accumulation de ROS (Qu et al., 2013b ; Yang et al., 2013). Le GO peut pénétrer dans le corps humain par inhalation et se déposer dans les régions des voies respiratoires. Lorsqu'il se dépose dans les régions alvéolaires, il peut entraver la clairance, former des granulomes et éventuellement produire une fibrose (Sanchez et al., 2012).

Le modèle in vivo utilisé dans cette étude était le nématode transparent, Caenorhabditis elegans (C. elegans), qui a été utilisé avec succès dans l'évaluation toxicologique de divers nanomatériaux tels que les NPs de GO (Zhang et al., 2012 ; Wu et al., 2013 ; Piechulek et von Mikecz, 2018). Les avantages de C. elegans comme système modèle in-vivo sont les suivants : (1) anatomie simple, (2) transparent, (3) lignée cellulaire invariante, (4) cycle de vie court avec une grande taille de couvée, (5) embryons facilement accessibles, (6) entretien facile et bon marché en laboratoire, et (7) outil expérimental puissant (Brenner, 1974 ; Hunt, 2017). Le modèle C. elegans n'est pas un modèle de mammifère à indisponible pour examiner plusieurs points finaux toxiques comme la glycémie et la pression artérielle, les tissus de la peau, le système probiotique dans l'intestin, les maladies cardiaques et cardiovasculaires. C. elegans est considéré comme un nouvel outil pour les techniques in-vivo, et les tests sur C. elegans sont connus pour être analogues aux tests sur les neurotoxines des mammifères (Cole et al., 2004).

Récemment, les scientifiques se sont concentrés sur la perturbation des effets biologiques des ROS, des effets sur la reproduction, de l'expression génétique, du développement neurologique et du comportement neurologique avec le traitement des NP de GO dans des modèles de C. elegans (Wu et al., 2013 ; Qu et al., 2017 ; Kim et al., 2018 ; Rive et al., 2019 ; Kim et al., 2020 ; Zhao et al., 2020). Zhang et al. (2012) n'ont pas indiqué d'impact négatif sur la longévité après avoir exposé des C. elegans L4-larves à jeunes adultes à des NP de GO à des concentrations allant de 5 à 20 mg L-1. Inversement, des C. elegans soumis à une exposition prolongée (de la larve L1 au jeune adulte) à 0,5-100 mg L-1 de NP de GO ont présenté des effets négatifs sur les organes cibles primaires (organes digestifs tels que l'intestin) et secondaires (tissus neurologiques tels que les neurones et organes reproducteurs) (Wu et al., 2013).

Les NP de GO ont probablement réduit la durée de vie en influençant l'expression de la cascade de signalisation DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 dans l'intestin des nématodes (Zhao et al., 2016b). Après l'exposition aux NP de GO, l'expression des substances neuronales peut diminuer la génération de ROS et réduire le comportement de locomotion des nématodes (Zhao et al., 2020). Les NP de GO ont probablement causé des dommages aux neurones dopaminergiques et glutamatergiques chez C. elegans après une exposition chronique aux NP de GO pendant 6 jours, de la larve L1 au stade adulte (Li et al., 2017). Liu et al. (2020) ont observé que les NP de GO induisaient un dysfonctionnement de la barrière intestinale chez C. elegans. Rive et al. (2019) ont proposé que les vers exposés de manière chronique (ou prolongée) aux NP de GO (niveaux de 100 et 200 mg L-1) avaient une taille significativement raccourcie et développaient des anomalies morphologiques dans le pharynx et l'intestin.

Kim et al. (2018) ont constaté l'accumulation de NP de GO dans les organes reproducteurs de C. elegans en utilisant la spectrométrie Raman. De plus, l'exposition aux NP de GO a favorisé la toxicité reproductive en supprimant la spermatogenèse de C. elegans pendant le développement, ce qui a entraîné une diminution du nombre de spermatozoïdes et de la descendance (Kim et al., 2018). Cette étude visait à évaluer l'effet de concentrations de NP de GO pertinentes pour l'environnement chez C. elegans en évaluant les paramètres toxicologiques, notamment la létalité aiguë, la reproduction, la locomotion, la durée de vie et l'expression génétique.

Méthodes

Préparation de nanoparticules d'oxyde de graphène

Les NP de GO ont été préparées à partir de graphite expansible en utilisant une méthode modifiée de Hummers (Yan et al., 2014). En bref, 1 g de puissance de graphite et 50 mL d'acide sulfurique (H2SO4, 98%) ont été versés dans un ballon de 250 mL, suivis de l'ajout de 0,5 g de NaNO3. Le mélange a été agité mécaniquement pendant 30 min dans un bain de glace. Pour poursuivre l'oxydation, 5 g de permanganate de potassium (KMnO4) ont été ajoutés tout en agitant lentement le mélange pendant 4 h. Ensuite, H2O2 a été ajouté au MnO2 jusqu'à ce que le mélange devienne jaune. Ensuite, du HCl 1% a été ajouté, et le mélange a été centrifugé à 8000 rpm pendant 5 min, puis lavé 3 fois avec de l'eau distillée pour diluer la solution acide.

Réactifs, produits chimiques et culture des nématodes

Les nanoparticules de GO ont été soumises à une sonication pendant 30 minutes (40 kHz et 100 W) pour les disperser dans un milieu K (50 mM, 30 mM KCl, 1,0 mg mL-1 et PH de 6,0) comme solution mère (200 mg L-1) en suivant les méthodes des études précédentes (Wu et al., 2013 ; Zhao et al., 2016b). La solution mère a été diluée à différentes concentrations en utilisant du milieu K avant l'exposition.

La souche N2 de C. elegans de type sauvage a été offerte par le Dr Chang-Shi Chen du département de biochimie et de biologie moléculaire de la faculté de médecine de l'université nationale Cheng Kung (Tainan, Taiwan). C. elegans a été maintenu sur un milieu de croissance pour nématodes (NGM) ensemencé avec des cultures d'Escherichia coli (E. coli) OP50 provenant du Bioresources Collection and Research Center (Hsinchu, Taiwan), et le bouillon Luria-Bertani a été obtenu auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Les plaques NGM contenaient de la gélose bactériologique et du bactopeptone, qui ont été obtenus auprès des Laboratoires Conda (S.A., Espagne). Le NaCl a été obtenu auprès de Honeywell Fluka™ (New Jersey, USA). Les vers synchronisés par l'âge ont été collectés à l'aide d'un mélange de blanchiment contenant du NaOCl obtenu auprès de J.T. Baker (Central Valley, PA) et du KOH obtenu auprès de Duksan Pure Chemicals (Gyeonggi-do, Corée du Sud).

Les réactifs supplémentaires tels que CaCl2, K2HPO4 et le cholestérol ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) ; MgSO4 a été acquis auprès d'Avantor Performance Materials, ltd. (Gyeonggi-do, Corée du Sud) ; le KH2PO4 utilisé pour le tampon phosphate a été acquis auprès d'Avantor Performance Materials, LLC (Radnor, PA, USA), et le Na2HPO4 utilisé pour le tampon M9 a été obtenu auprès de Honeywell Fluka™ (New Jersey, USA). Toutes les observations physiologiques ont été faites sous un microscope à dissection (Olympus, SZX10, Waltham MA, USA). Les protocoles expérimentaux dans le modèle de nématode ont suivi ceux utilisés dans notre étude précédente (Chung et al., 2019, 2020). Les examens de létalité, de croissance, de reproduction, de comportement de locomotion ont suivi les protocoles précédemment publiés, avec des modifications mineures (Chung et al., 2019, 2020).

Essai de létalité et de durée de vie

Les nématodes ont été exposés aux NP de GO (contrôle, 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 µg L-1) pendant 48 h (exposition prolongée), des larves L1 aux jeunes adultes incubés à 20°C. L'exposition prolongée a été effectuée dans une plaque fraîche avec un gazon d'E. coli OP50. Après le traitement, la toxicité létale des échantillons a été évaluée en les piquant doucement à l'aide d'un tire- vers. Les vers qui ne répondaient pas étaient considérés comme morts. Trois répétitions biologiques ont été effectuées, et un total de 150 vers ont été évalués.

Les vers évalués pour le test de durée de vie ont été exposés pendant une période prolongée aux différentes concentrations de NP de GO (le témoin non traité, 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 µg L-1) de L1 au stade mature pour le test de durée de vie. Cinquante vers ont été transférés sur des plaques fraîches tous les deux jours pendant 4-5 jours de ponte. Les nématodes vivants et morts ont été évalués chaque jour en les piquant doucement avec un ramasseur de vers. Trois répétitions biologiques ont été effectuées, et un total de 150 vers ont été évalués. Plusieurs indicateurs de durée de vie (durée de vie moyenne, jour de la mort du 50e centile, jour de la mort du 75e centile, jour de la mort du 95e centile et jour de la mort totale) ont été évalués en suivant l'étude de Chung (Chung et al., 2020).

Essai de reproduction et essai de locomotion

La taille du couvain (test de reproduction) des nématodes L3 ou des jeunes L4 a été évaluée pendant 4 à 5 jours après une exposition prolongée à différentes concentrations de NP de GO (témoin, 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 µg L-1) à 20°C. Chaque ver a été transféré sur une plaque fraîche et transféré à nouveau jusqu'à l'arrêt de la ponte. Les plaques contenant des œufs ont été incubées jusqu'à ce que la progéniture puisse être facilement comptée. Un total de 30 vers a été évalué pour l'essai de reproduction.

Le comportement de locomotion, y compris le battement de tête et la flexion du corps dans les modèles de nématodes, a été exprimé comme la fonction des neurones moteurs (Qu et al., 2019 ; Zhao et al., 2020). La flexion du corps et le battement de la tête des nématodes (essai de locomotion) ont été évalués après une exposition prolongée à diverses concentrations de NP de GO (contrôle, 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 µg L-1). La flexion du corps a été évaluée en transférant le ver exposé sur une plaque fraîche. Après un jour, la flexion du corps des vers a été comptée pendant 20 secondes. Le battement de la tête a été évalué en plaçant le ver exposé sur une lame de verre contenant une quantité adéquate de milieu K. Le battement de la tête des vers a été compté pendant 1 minute. Trois répétitions biologiques ont été effectuées : 60 vers ont été évalués pour la flexion du corps et 30 pour le choc de la tête.

Tests d'expression génétique

Les C. elegans des différents groupes de traitement (contrôle non traité, 0,00100, 0,100 et 1,00 µg L-1) ont été collectés à partir de trois répétitions pour l'extraction de l'ARN après l'exposition. Le réactif Trizol (TIANGEN, Chine) a été utilisé pour extraire l'ARN total conformément au protocole standard du fabricant. Les concentrations d'ARN ont été mesurées par l'absorbance à 260 nm, et la pureté de l'ARN a été évaluée sur la base du rapport des densités optiques des échantillons d'ARN mesurées à 260 et 280 nm. La réaction de synthèse d'ADNc premier brin a été réalisée avec 500 ng d'ARN purifié à l'aide d'un kit RT Fast Quant (avec gDNase) selon le protocole du fabricant (TIANGEN, Chine).

Des gènes spécifiques de superoxyde dismutase, notamment (sod) 1 (sod-1), sod-3, et catalase 2 (ctl-2) ont été détectés dans la présente étude. Les données ont été analysées à l'aide de la méthode 2-ΔΔCt, comme indiqué précédemment (Zhou et al., 2016), et les expressions des ARNm ont été normalisées sur la base de l'ARNm act-1. Pour chaque gène testé, une analyse par qRT-PCR a été réalisée en triplicata (réplicats techniques).

Analyse statistique

Le logiciel Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 12 (International Business Machines Corp., New York, USA) a été utilisé pour effectuer toutes les analyses statistiques. La normalité de toutes les données a été vérifiée, et le test de Shapiro-Wilk a été utilisé pour déterminer la distribution normale et non normale. Une ANOVA à sens unique a été utilisée pour analyser les niveaux de signification des différences entre les traitements. Les graphiques et les figures ont été réalisés à l'aide de GraphPad Prism 6 (San Diego, Californie, USA).

Résultats et discussion

Létalité de GO NPs

Dans la présente étude, C. elegans a été évalué selon divers critères toxicologiques, notamment la létalité, la reproduction, la locomotion, la durée de vie et le stress oxydatif (expression génétique de sod-1, sod-3 et clt-2). Cette étude est la première fois que de faibles doses de NP de GO (environ au moins 1000 fois plus faibles que celles utilisées dans les études précédentes) ont été utilisées pour examiner la nanotoxicité dans un modèle C. elegans. L'exposition de la larve L1 au jeune adulte a été réalisée pour évaluer les effets d'une exposition prolongée au GO sur les larves et les nématodes adultes. Comme le montre la figure 1, le taux de survie des nématodes après une exposition prolongée au GO n'a pas indiqué d'effets létaux significatifs. Aucune différence significative entre les groupes en termes de mortalité n'a été observée dans le groupe témoin et dans le groupe traité avec des concentrations allant de 0,00100 à 1,00 μg L-1.

Peu d'études ont examiné la toxicité aiguë des NP de GO dans des modèles N2 de C. elegans (Wu et al., 2013, 2014 ; Li et al., 2019). Wu et al. (2013) ont indiqué qu'aucune létalité n'a été observée à des concentrations de NP de GO de 0,100 à 100 mg L-1 après que les vers aient été exposés de manière aiguë ou prolongée à ces ENM à base de carbone. Au contraire, une étude examinant la toxicité aiguë avec le traitement de fortes doses de 5, 10, 50 et 100 mg L-1 de NP de GO chez les nématodes a révélé que les concentrations de GO supérieures à 5 mg L-1 peuvent provoquer une létalité, où aucun ver n'a survécu à une dose de 100 mg L-1 (Li et al., 2017).

Wu et al. (2014) ont également examiné de faibles niveaux de NP de GO de 0,00100 à 1,00 mg L-1 et n'ont trouvé aucune différence significative dans la létalité, sauf dans le cas de la plus forte concentration de 1,00 mg L-1 après que les nématodes aient été exposés de manière chronique à ces ENM à base de carbone de la larve L1 au 8e jour adulte. La plupart des études GO NP se réfèrent à l'étude de Wu (Wu et al., 2013) et utilisent des niveaux de dosage similaires (niveaux ppm) pour examiner la toxicité neurologique, reproductive, neurocomportementale et immunologique, ainsi que les réponses inflammatoires.

Fig. 1. Taux de survie de C. elegans après une exposition prolongée à des NP de GO à des concentrations de 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 et au contrôle non traité. Les barres représentent la moyenne ± l'écart-type. Les différences significatives ont été exprimées par * p < 0,05, **p < 0,01, et ***p < 0,001.

 

Toxicité pour la reproduction des NP de GO

La reproduction chez les nématodes est un paramètre vital car il a été démontré qu'elle est sensible à des concentrations de facteurs de stress chimiques plus faibles que celles qui altèrent le comportement et la viabilité des nématodes (Wu et al., 2019). Les résultats de la figure 2 montrent que l'exposition prolongée des nématodes aux NP de GO a réduit la production de la taille du couvain. Une diminution significative a été observée dans le nombre de progénitures à des concentrations de 0,0100 (p = 0,036), 0,100 (p = 0,008) et 1,00 (p < 0,001) µg L-1 de NP de GO. Les taux de réduction de la taille du couvain à ces trois concentrations par rapport au groupe témoin étaient de 15,2, 20,1 et 27,3%, respectivement.

Les résultats ont montré que des concentrations plus élevées de NP de GO induisaient une plus grande toxicité reproductive sur la base de nos expériences sur le nombre de tailles de couvain chez les nématodes. Nos résultats étaient cohérents avec la plupart des études sur les NP de GO rapportant que l'exposition aux GO peut avoir des effets néfastes en nuisant à la fertilité et au comportement d'éjection des œufs des nématodes (Wu et al., 2013 ; Zhao et al., 2016a ; Kim et al., 2018 ; Rive et al., 2019). Wu et al. (2013) ont montré que C. elegans avec une exposition prolongée à 1-100 mg L-1 présentait une taille de couvain significativement réduite par rapport au contrôle, mais il n'y avait pas de différences significatives entre les groupes à 0,1 et 0,5 mg L-1. Un résultat similaire a également été trouvé dans une étude précédente (Rive et al., 2019), indiquant que l'exposition prolongée aux NP de GO à 100 et 200 mg L-1 a significativement diminué les taux de ponte par rapport au contrôle non traité.

Kim et al. (2018) ont révélé que l'accumulation de NP de GO (10 mg L-1) dans les organes reproducteurs, qui pourrait être la cause directe de la toxicité reproductive, pourrait réduire la taille du couvain et le nombre de spermatozoïdes en supprimant la spermatogenèse des nématodes hermaphrodites aux niveaux de GO de 5 ou 10 mg L-1. Cependant, l'impact négatif de l'exposition aux NP de GO sur la fonction de reproduction dans la présente étude et dans les études publiées (Wu et al., 2013 ; Zhao et al., 2016a ; Kim et al., 2018 ; Rive et al., 2019), ainsi que nos résultats, suggèrent que l'exposition prolongée aux NP de GO à de faibles doses de 0,0100 à 1,00 µg L-1 pourrait diminuer le nombre de descendants ou la fécondité dans les modèles N2 C elegans.

Fig. 2. Effets sur la taille de la couvée chez les C. elegans après une exposition prolongée aux NP de GO à des concentrations de 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 et au contrôle non traité. Les barres représentent la moyenne ± l'écart-type. Les différences significatives ont été exprimées par *p < 0,05, ** p < 0,01, et ***p < 0,001.

 

L'exposition à GO NP affecte le comportement des locomotives

Les tests de comportement locomoteur sont des méthodes bien établies pour étudier la neurotoxicité des nématodes. Après une exposition prolongée, le GO a induit des diminutions évidentes des mouvements de tête et de flexion du corps chez les nématodes (Fig. 3). Dans l'examen du choc de la tête, les concentrations de 0,0100, 0,100 et 1,00 µg L-1 de NP de GO ont significativement réduit le choc de la tête de 12,0, 5,41 et 19,8%, respectivement, par rapport au contrôle non traité. De plus, la flexion du corps a été significativement réduite aux concentrations de 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 µg L-1 de NPs de GO de 8,78, 21,2, 31,5 et 40,8%, respectivement, par rapport aux groupes témoins.

Nos résultats concordent avec ceux de la plupart des articles publiés, qui laissent entendre que l'exposition aux NP de GO endommage les fonctions neurologiques et perturbe de façon négative le comportement de propulsion de la tête et de flexion du corps (Wu et al., 2013, 2014 ; Zhao et al., 2015, 2016c ; Chen et al., 2017 ; Li et al., 2017 ; Qu et al., 2017 ; Kim et al., 2018 ; Rive et al., 2019 ; Zhao et al., 2020). Dans le rapport de Wu (Wu et al., 2014), la locomotion par poussée de la tête et par flexion du corps était significativement réduite aux niveaux de 0,0100, 0,100 et 1,00 mg L-1 par rapport à un contrôle non traité. Li et al. (2017) ont indiqué que l'exposition prolongée aux NP de GO (5,00-100 mg L-1) réduisait de manière significative la flexion du corps, les coups de tête, la fréquence de pompage du pharynx, la vitesse moyenne, l'angle-fréquence de flexion et la longueur d'onde du mouvement de reptation des nématodes. Les NP de GO ont également provoqué des dommages aux neurones dopaminergiques et glutamatergiques des nématodes (Li et al., 2017).

Kim et al. (2020) ont également proposé que le GO s'accumulait de manière significative dans les régions de la tête, générait l'induction de ROS, réduisait les substances neurotransmetteurs dans les neurones dopaminergiques et glutamatergiques, et endommageait les neurones AFD, qui sont les principaux thermocapteurs chez C. elegans, après que les nématodes aient été exposés aux NPs de GO (10 mg L-1). Dans une étude coréenne, Kim et al. (2018) ont également constaté que les neurotransmetteurs, tels que la dopamine, l'acide γ-Aminobutyrique (GABA), la tyramine, le tryptophane et la tyrosine, étaient réduits chez les nématodes exposés aux NPs de GO. Selon les données actuelles, y compris la présente étude (Wu et al., 2013, 2014 ; Zhao et al., 2015, 2016a ; Chen et al., 2017 ; Li et al., 2017 ; Qu et al., 2017 ; Kim et al., 2018 ; Rive et al., 2019 ; Zhao et al, 2020), il a été conclu que l'exposition aux NP de GO provoque des effets néfastes sur le système neurologique de C. elegans, notamment en termes de dommages aux neurones, d'influences sur les neurotransmetteurs et de retards dans le développement neurocomportemental. Dans la présente étude, des niveaux environnementaux (0,0100-1,00 µg L-1) de doses de NP de GO ont été utilisés pour traiter les nématodes afin de déterminer l'impact négatif sur leur comportement de locomotion.

Fig. 3. Effets du battement de la tête et de la flexion du corps chez les nématodes après une exposition prolongée aux NP de GO à des concentrations de 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 et au contrôle non traité. Les barres sont représentées par des moyennes ± SD. Les différences significatives ont été exprimées par *p < 0,05, **p < 0,01, et ***p < 0,001.

 

Effet des NP de GO sur la durée de vie

Dans les modèles de C. elegans, la durée de vie est un critère important pour l'évaluation des substances toxiques. Après une exposition prolongée chez les nématodes, les NP de GO à des concentrations de 0,00100-1,00 µg L-1 ont entraîné des durées de vie plus courtes que celles des témoins non traités (Fig. 4). Plusieurs indicateurs de la durée de vie, y compris la durée de vie moyenne (Fig. 4(b)), le jour moyen de la mort médiane (50e percentile) (Fig. 4(c)), le jour moyen de la mort du 75e percentile (Fig. 4(d)), le jour moyen de la mort du 95e percentile (Fig. 4(e)) et le jour de tous les décès (Fig. 4(a)) ont indiqué une longévité significativement plus longue chez les témoins non traités que chez les nématodes exposés aux NP de GO (p < 0,001). La durée de vie moyenne et le jour de tous les décès étaient de 13,9, 7,01, 6,23, 6,94 et 6,35 jours dans le témoin non traité et 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 µg L-1, respectivement, et de 20, 16, 14, 14, 16 jours dans le témoin non traité et 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 µg L-1, respectivement. Après 6 jours, le taux de survie des nématodes a diminué jusqu'à 50% de la population totale.

Il a également été observé que les nématodes traités avec des NP de GO présentaient des réductions de durée de vie plus rapides que le groupe témoin. En résumé, la figure 4 indique que l'exposition prolongée aux NP de GO réduit la durée de vie des nématodes (p < 0,001). Selon les données actuelles des rapports précédents (Zhang et al., 2012 ; Zhao et al., 2016b, 2016c ; Qu et al., 2017 ; Rive et al., 2019), des résultats contradictoires ont été obtenus, où deux études ont indiqué que l'exposition aux NP de GO, y compris l'exposition aiguë et prolongée n'avait pas d'effets sur la longévité (Zhang et al, 2012 ; Rive et al., 2019), et d'autres études ont obtenu des résultats différents indiquant que les vers ayant subi une exposition prolongée aux NP de GO présentaient une longévité significativement réduite (Zhao et al., 2016b, 2016c ; Qu et al., 2017) à des concentrations de NP de GO comprises entre 1,00 et 200 mg L-1. Deux mécanismes moléculaires de signalisation de l'insuline intestinale peuvent être impliqués dans la longévité réduite des nématodes exposés à une concentration de NP de GO de 100 mg L-1 en raison de l'association avec la suppression des fonctions de DAF-16 et de sod-3 (Zhao et al., 2016b). D'après nos résultats, la faible dose de 0,00100 µg L-1 a réduit significativement la longévité des nématodes.

Fig. 4. Durée de vie de C. elegans après une exposition prolongée aux NP de GO à des niveaux de 0,00100, 0,0100, 0,100 et 1,00 µg L-1 et au contrôle (a) évaluation nanotoxique des vers avec une exposition prolongée au GO pour la durée de vie, (b) durée de vie moyenne, (c) jour moyen de la mort au 50e centile, (d) jour moyen de la mort au 75e centile et (e) jour moyen de la mort au 95e centile. Les barres représentent la moyenne ± l'écart-type. Les différences significatives sont exprimées par *p < 0,05, **p < 0,01, et ***p < 0,001.
Expression des gènes après exposition aux NP de GO

Les gènes sod codent pour les superoxyde dismutases (SOD), qui comprennent un système antioxydant pour C. elegans contre le stress oxydatif après l'exposition au NP GO (Ren et al., 2018). Les SOD qui existent en trois isoformes de sod1, sod2, et sod-3 sont une classe de la protéine antioxydante. La figure 5 montre l'augmentation de l'expression des gènes sod-1, sod-3 et ctl-2 induits après que C. elegans ait subi une exposition prolongée à 0,00100, 0,100 et 1,00 µg L-1 de NP de GO par rapport au contrôle non traité. Les expressions activées de sod-1, sod-3 et ctl-2 aux concentrations de 0,00100, 0,100 et 1,00 µg L-1 chez les C. elegans exposés à la NP de GO étaient significativement plus élevées que celles du témoin non traité. La SOD est une enzyme clé dans la fonction de détoxification des radicaux libres.

Elle a éliminé les radicaux libres générés par les NPs de GO dans les sources extracellulaires des nématodes. Des résultats similaires à ceux trouvés dans la présente étude ont également été trouvés dans des études précédentes (Wu et al., 2013 ; Zhao et al., 2016b), ce qui indique que les NP de GO pourraient induire l'activation de sod-1 ou sod-3. Les résultats de l'étude de Wu ont suggéré que le stress oxydatif induit dans les nématodes NP de GO traités pourrait être lié à des modifications des activités de la SOD (Wu et al., 2013). Sur la base de ces résultats, on peut déduire que le stress oxydatif est un mécanisme possible causant des effets néfastes sur le développement neurologique et neurocomportemental après une exposition prolongée au GO NP, comme suggéré dans des rapports précédents (Wu et al., 2013 ; Zhao et al., 2016b), en combinaison avec les résultats de l'activation de la SOD induite et de la neurotoxicité chez les nématodes exposés au GO dans la présente étude (figures 3 et 5).

En outre, l'activation de sod-1, sod-3 et ctl-2 peut être associée à la longévité réduite chez les vers exposés à GO, d'après les figures 4 et 5. Dans l'étude de Zhou (Zhou et al., 2016), le gène ctl-2 de C. elegans, codant pour la catalase peroxysomale, était lié au stress oxydatif environnemental après l'exposition des vers au bisphénol A. Peu d'études ont porté sur le lien entre l'expression de ctl-2 et l'exposition au GO chez C. elegans. Bien qu'une association positive entre l'expression de ctl-2 et l'exposition au GO NP ait été montrée dans la présente étude, le mécanisme n'est toujours pas clair.

Fig. 5. Expression génique chez C. elegans après une exposition prolongée aux NP de GO aux niveaux du contrôle non traité, 0,00100, 0,100 et 1,00 µg L-1 (a) SOD-1 (C15F1.7), (b) SOD-3 (C08A9.1) et (c) ctl-2 (Y54G11A.5) ; Actin-1 (T04C12.6) comme contrôle interne. Les barres représentent la moyenne ± SD. Les différences significatives ont été exprimées par *p < 0,05, **p < 0,01, et ***p < 0,001.

Enfin, la présente étude a permis de conclure que des doses extrêmement faibles de NP de GO, comparées aux doses discutées dans des articles publiés récemment, peuvent provoquer une toxicité reproductive et neurocomportementale et induire une multiplication de l'expression des gènes sod-1, sod-3 et clt-2. Il convient de noter que dans la présente étude, les effets potentiellement toxiques des niveaux environnementaux de NP de GO dans les modèles in-vivo de C. elegans ont été évalués pour montrer les impacts négatifs sur la reproduction, le développement neurocomportemental et le stress oxydatif. Il est donc réaffirmé que, sur la base de nos résultats, les NP de GO à des niveaux environnementaux peuvent avoir des effets toxiques chroniques.

Conclusions

C'est la première fois qu'une faible dose de NP de GO est utilisée dans un modèle in-vivo pour déterminer les effets indésirables sur les nématodes. D'après nos résultats, l'exposition prolongée aux NP de GO entraîne des effets sur la reproduction, génère une neurotoxicité, réduit la longévité et induit un stress oxydatif chez C. elegans. Nous rappelons que de faibles doses de NP de GO à des niveaux environnementaux de 0,00100 à 1,00 µg L-1 ont eu des effets négatifs significatifs sur les nématodes, contrairement aux données publiées actuellement. Ainsi, les effets négatifs des NP de GO à faible dose sur la santé humaine devraient être évalués à l'avenir.

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