Nanomateriales de grafeno: Síntesis, biocompatibilidad y citotoxicidad


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El grafeno, el óxido de grafeno y el óxido de grafeno reducido han sido ampliamente considerados como candidatos prometedores para aplicaciones industriales y biomédicas debido a su rigidez y resistencia mecánicas excepcionalmente altas, su excelente conductividad eléctrica, su alta transparencia óptica y su buena biocompatibilidad.

Resumen

En este artículo revisamos varias técnicas disponibles para la síntesis de nanomateriales basados en el grafeno, y analizamos la biocompatibilidad y toxicidad de dichos nanomateriales tras su exposición a células de mamíferos en condiciones in vitro e in vivo. Se han desarrollado diversas estrategias de síntesis para su fabricación, generando nanomateriales de grafeno con diferentes propiedades químicas y físicas. Por ello, sus interacciones con las células y los órganos se ven alteradas en consecuencia. En la literatura se han publicado resultados contradictorios sobre la biocompatibilidad y la citotoxicidad inducida por los nanomateriales de grafeno.

En particular, los nanomateriales de grafeno que se utilizan para los cultivos celulares in vitro y los modelos animales in vivo pueden contener residuos químicos tóxicos, lo que interfiere en las interacciones grafeno-célula y complica la interpretación de los resultados experimentales. Las técnicas de síntesis, como la exfoliación en fase líquida y la oxidación química en húmedo, suelen requerir disolventes orgánicos tóxicos, tensioactivos, ácidos fuertes y oxidantes para exfoliar las escamas de grafeno. Esas moléculas orgánicas e impurezas inorgánicas que quedan retenidas en los productos finales de grafeno pueden interactuar con las células y los tejidos biológicos, induciendo toxicidad o causando eventualmente la muerte celular. Los contaminantes residuales pueden causar un mayor riesgo de toxicidad inducida por el grafeno en las células biológicas. Este efecto adverso puede ser en parte responsable de las discrepancias entre diversos estudios en la literatura.

Introducción

La nanotecnología es un campo de investigación multidisciplinar que abarca diversas disciplinas, como la biología, la química, la ingeniería, los materiales, la ciencia médica y la física. En concreto, la nanotecnología implica la creación y el desarrollo de nuevos materiales y dispositivos mediante la manipulación de las propiedades y funciones de la materia a escala nanométrica. A esta escala de longitud, los comportamientos químicos, mecánicos, físicos y biológicos de los materiales difieren sustancialmente de sus homólogos de la materia a gran escala. La nanotecnología es muy prometedora para el desarrollo y la síntesis de nanomateriales con propiedades químicas, biológicas, mecánicas y físicas únicas. Al introducir la nanotecnología en el sector médico, los científicos son capaces de desarrollar nuevos materiales y estrategias para la detección precisa y la prevención de enfermedades malignas, nuevos implantes médicos y prótesis artificiales con buena biocompatibilidad. [1,2,3]

Los materiales basados en el carbono, como los nanotubos de carbono y el grafeno, son ampliamente conocidos por poseer un módulo de Young y una resistencia mecánica excepcionalmente elevados, una alta transmisión de la luz y una excelente conductividad eléctrica. Estas atractivas propiedades han suscitado un gran interés en el uso de estos materiales para la fabricación de dispositivos electrónicos, materiales compuestos, suministro de fármacos, implantes médicos, etc. Por ejemplo, los nanotubos de carbono (CNT) unidimensionales son candidatos prometedores para la administración de fármacos en células biológicas debido a su estructura hueca. [4-9, 10-18]

Los CNT con aspecto de aguja pueden penetrar fácilmente en la membrana plasmática, transportando así moléculas terapéuticas con eficacia. Sin embargo, los nanotubos que penetran en las células también pueden ser perjudiciales para las células biológicas porque inducen una toxicidad y una apoptosis apreciables. Las observaciones al microscopio electrónico han revelado la presencia de nanotubos en el citoplasma, induciendo así un estrés oxidativo, reduciendo la actividad metabólica y provocando finalmente la muerte celular. A este respecto, la aplicación de los nanotubos de carbono en el ámbito clínico se ve obstaculizada por su biodistribución, tamaño y forma. [19-23]

El grafeno es una monocapa bidimensional de átomos de carbono con hibridación sp2 unidos covalentemente en una red hexagonal. Es un bloque básico para los materiales de carbono de todas las demás dimensionalidades, incluyendo la bola Bucky 0D y el punto cuántico de grafeno (GQD), el nanotubo de carbono 1D y el grafito 3D (Figura 1). El grafeno fue aislado por primera vez del grafito por Geim y Novoselov a través de la escisión mecánica utilizando una cinta scotch para fijar los copos de las capas de grafeno. La lámina de grafeno exfoliada mecánicamente es pura y sin defectos, pero su rendimiento es muy pequeño. Su aplicación se limita a la investigación para estudiar las propiedades eléctricas, mecánicas y ópticas del grafeno puro. Por ello, los investigadores han llevado a cabo numerosos estudios para sintetizar grafeno a gran escala, incluidos sus derivados, como el óxido de grafeno (GO), el óxido de grafeno reducido (rGO) y el óxido de grafeno reducido térmicamente (TRG). Las notables propiedades eléctricas, mecánicas y ópticas de las láminas de grafeno y los GQD los convierten en materiales atractivos para su uso en la industria electrónica, optoelectrónica y aeroespacial. [14, 24-34]

Figur 1
Figura 1 Materiales carbonosos de diferentes dimensiones. Reproducido con permiso de Taylor & Francis.

El grafeno y sus derivados, así como los GQD, también han surgido rápidamente como materiales prometedores para su uso en el sector biomédico, como los biosensores, la ingeniería de tejidos, la bioimagen, la administración de fármacos y la terapia fototérmica (Figura 2). Los GQDs generalmente presentan fotoluminiscencia debido a un efecto de confinamiento cuántico. Por ello, los GQDs encuentran aplicaciones en el campo biomédico para la obtención de imágenes y sensores. Por ejemplo, los GQDs derivados de hojas de plantas con atractivas propiedades fotoluminiscentes son especialmente adecuados para la bioimagen, incluyendo el pez cebra y las líneas celulares de cáncer humano. El pez cebra puede crecer sano en presencia de GQDs (< 2 mg/mL). [2,18,38,39,40,41,42]

La principal preocupación en el uso de materiales basados en el grafeno para aplicaciones biomédicas es su biocompatibilidad. Según los trabajos establecidos en la literatura, la biocompatibilidad del grafeno y sus derivados suele ser contradictoria. Los efectos de los nanomateriales de grafeno sobre la viabilidad celular dependen de varios factores y condiciones experimentales. Por ello, es necesario investigar la biocompatibilidad y la toxicidad del grafeno y sus derivados mediante cultivos celulares in vitro y modelos animales in vivo. Chang et al. descubrieron que el GO no entra en las células A549 (células epiteliales basales alveolares humanas) y no muestra una citotoxicidad evidente. Sin embargo, el GO tiende a inducir un estrés oxidativo dependiente de la dosis en las células, causando una pequeña reducción de la viabilidad celular a altas concentraciones. Estos efectos están relacionados con la dosis y el tamaño. Del mismo modo, Wang et al. informaron de que el GO presenta una toxicidad dependiente de la dosis en células de fibroblastos humanos y en ratones. Sus resultados revelaron que el GO con dosis menores a 20 μg/mL no exhibe toxicidad para las células de fibroblastos humanos. A dosis superiores a 50 μg/mL, se observa una citotoxicidad evidente, como la reducción de la adhesión celular y la apoptosis celular. [43-47]

En los ensayos in vivo con ratones, las dosis bajas (0,1 mg) y medias (0,25 mg) de GO no muestran una toxicidad evidente, pero una dosis alta (0,4 mg) provoca una toxicidad crónica, que provoca la muerte de los ratones y la formación de granulomas pulmonares. Yang et al. investigaron la biodistribución in vivo del grafeno funcionalizado con polietilenglicol (PEG) en ratones. Indicaron que el grafeno funcionalizado con PEG no induce una toxicidad apreciable con una dosis de 20 mg/kg durante tres meses. Esta revisión resume la síntesis del grafeno y sus derivados, y los efectos de las interacciones entre los nanomateriales basados en el grafeno con las células de mamíferos en condiciones in vitro e in vivo. Las interacciones de los nanomateriales de grafeno con las células biológicas son cruciales para la evaluación de la bioseguridad con el fin de garantizar su uso seguro en los sectores biomédicos. [48]

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Figura 2 Aplicaciones de los nanomateriales de grafeno en la ingeniería biomédica. Reproducido con permiso de la American Chemical Society.

Síntesis de nanomateriales basados en el grafeno

Por lo general, el grafeno puede sintetizarse tanto por la vía descendente como por la ascendente. La ruta descendente incluye la escisión micromecánica del grafito, la exfoliación en fase líquida y la exfoliación química del grafito para producir GO, seguida de tratamientos químicos o térmicos para obtener rGO o TRG, respectivamente. La ruta de fabricación ascendente incluye la deposición química de vapor y el crecimiento epitaxial sobre el sustrato de SiC (Figura 3). [49]

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Figura 3 Varios métodos utilizados para fabricar grafeno. Reproducido con permiso de Springer Nature.
Grafeno epitaxial en obleas de SiC

Las películas de grafeno pueden crecer en obleas de SiC mediante la sublimación superficial de los átomos de Si de las obleas en ultra alto vacío (UHV) a altas temperaturas (normalmente por encima de 1000 °C). Como resultado, los dominios de carbono sobrantes quedan en la superficie de la oblea y se reconstruyen para producir grafeno. Sin embargo, el alto coste y el pequeño tamaño de las obleas de SiC y la necesidad de un sistema de UHV a altas temperaturas impiden la adopción de este proceso para la producción de grafeno a gran escala en las industrias. [50,51]

Películas de grafeno depositadas por vapor químico

La deposición química de vapor (CVD) suele emplearse para fabricar películas de grafeno monocapa de gran superficie sobre metales de transición (Fe, Ni, Co, Pt, Ru, etc.) admitiendo gas hidrocarburo, como metano, etano o propano, en la cámara de reacción a altas temperaturas. Los sustratos de Cu o Ni se utilizan habitualmente debido a su bajo coste, y sirven de catalizador para la descomposición del gas hidrocarburo (Figura 4). A continuación, las películas finas se transfirieron a sustratos objetivo como SiO2/Si, vidrio o polímero flexible como el poli(tereftalato de etileno) (PET). La deposición y el crecimiento de las películas de grafeno se realizan en dos pasos. El primer paso consiste en una pirólisis inicial del precursor para formar carbono. A continuación, se forma la estructura grafítica a partir de los átomos de carbono disociados. [52-54]

En general, el crecimiento por CVD del grafeno sobre un sustrato de Cu con baja solubilidad del carbono se produce mediante un mecanismo de adsorción superficial. En el proceso, el precursor de carbono se descompone y se adsorbe sólo en la superficie del metal, seguido de la migración y el crecimiento. En cambio, el grafeno sobre el Ni tiene lugar a través de la segregación y precipitación del carbono. Las especies de carbono se descomponen a partir del gas hidrocarburo y se difunden en la superficie del metal de níquel con alta solubilidad de carbono a temperaturas elevadas para crear una solución sólida. Durante el enfriamiento, la solubilidad del carbono disminuye, lo que permite que los átomos de carbono se difundan fuera del metal y luego precipiten en la superficie de Ni para producir grafeno. Hay varios factores que pueden afectar al crecimiento y la calidad de las películas de grafeno, como los tipos de materiales del sustrato y los parámetros de procesamiento del CVD, como el tipo de gas precursor, la concentración, el caudal y la temperatura. [52-55]

Las películas de grafeno formadas por islas de grafeno orientadas al azar son policristalinas y tienen una alta densidad de límites de grano. Estos defectos en los límites de grano degradan en gran medida las propiedades eléctricas de las películas de grafeno, ya que sirven como centros de dispersión para los electrones, lo que resulta en una movilidad reducida como se esperaba. En este sentido, se desea fabricar películas de grafeno con granos grandes con menos límites de grano, o incluso películas de grafeno monocristalino. Recientemente, Xu et al. fabricaron grafeno monocristalino de gran superficie (5 × 50 cm2) sobre una lámina monocristalina de Cu(111) de un metro de tamaño mediante el crecimiento epitaxial de islas de grafeno sobre la superficie de cobre. La película de grafeno sintetizada tenía una movilidad de hasta 23.000 cm2 V-1 s-1 a 4 K. Las películas de grafeno de alta calidad obtenidas por CVD tienen aplicaciones atractivas en la fabricación de paneles táctiles plegables, pantallas y dispositivos optoelectrónicos. [56]

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Figura 4 Diagrama esquemático que muestra la deposición de grafeno sobre (a) sustratos de cobre y (b) de níquel. Reproducido con permiso de la American Chemical Society.

En general, para las aplicaciones prácticas es necesario transferir directamente la película de grafeno desde láminas de Cu o Ni a un sustrato de destino, como SiO2/Si, vidrio o PET. Este proceso de transferencia del grafeno puede inducir defectos, como arrugas y grietas, que son perjudiciales para sus propiedades eléctricas y ópticas. Para eliminar el proceso de transferencia, se ha explorado la síntesis directa de grafeno sobre materiales no metálicos, como el nitruro de boro hexagonal, sin necesidad de transferirlo a otro sustrato. Sin embargo, el crecimiento directo del grafeno es muy lento y el tamaño final de la película de grafeno también está limitado en ausencia de catalizadores de metales de transición Cu o Ni.

En consecuencia, el alto coste de producción y el tedioso proceso de transferencia de la película son los principales obstáculos para la comercialización del grafeno por CVD en la actualidad. Dado que el CVD térmico requiere una temperatura elevada de 800-1000 °C para el crecimiento de las películas de grafeno, resulta de interés práctico reducir las temperaturas o presiones de procesamiento, lo que permitiría la fabricación de grandes superficies con un coste menor. Las presiones reducidas pueden minimizar las reacciones no deseadas en fase gaseosa y lograr la uniformidad de la película en todo el sustrato. Ruoff y sus colaboradores demostraron que las películas de grafeno monocristalino pueden sintetizarse mediante deposición química de vapor a baja presión (LPCVD) en recintos de lámina de cobre utilizando metano como precursor. Estas películas de LPCVD mostraron una movilidad de portadores superior. [28,57,58]

Exfoliación en fase líquida

La exfoliación en fase líquida (LPE) es una ruta escalable para la producción masiva de grafeno debido a su bajo coste y simplicidad. En el proceso, el grafito se dispersa en un disolvente para debilitar las fuerzas de Van der Waals entre las intercapas de grafeno en presencia o ausencia de tensioactivos. Para facilitar la exfoliación del grafito en láminas de grafeno puede emplearse la ultrasonicación o el cizallamiento. A continuación, se realiza una etapa de purificación para obtener hojas de grafeno de una o varias capas. Esta estrategia permite la síntesis de láminas de grafeno exfoliadas en forma de suspensión con disolventes. Dado que se utilizan tensioactivos, disolventes orgánicos y ácidos fuertes para exfoliar y estabilizar las láminas de grafeno en el medio específico, pueden causar problemas de contaminación ambiental. Además, los tensioactivos residuales son difíciles de eliminar de las láminas de grafeno. La mayoría de los disolventes orgánicos (por ejemplo, N,N-dimetil-formamida (DMF); N-metil-2-pirrolidona (NMP); diclorobenceno (DCB)) utilizados son altamente tóxicos; pueden inducir toxicidad celular; y, deben evitarse para fines de manipulación celular. [30]

Reducción química y térmica del GO

El óxido de grafeno es un derivado del grafeno producido por oxidación química de escamas de grafito en agentes oxidantes fuertes. El proceso Hummers modificado se utiliza ampliamente para producir GO haciendo reaccionar copos de grafito con una mezcla de ácido sulfúrico, nitrato de sodio y permanganato de potasio bajo agitación vigorosa o sonicación. La suspensión se diluye con agua, y a continuación se añade peróxido de hidrógeno para conseguir un mayor grado de oxidación, seguido de un aclarado con agua. Los inconvenientes de este proceso son los largos tiempos de procesamiento y la generación de gases tóxicos (NO2 y N2O4). Para solucionar estos problemas, Tour y sus colaboradores modificaron este método sustituyendo el nitrato de sodio por ácido fosfórico en una proporción mixta H2SO4/H3PO4 (9:1) y aumentando la concentración de KMnO4. La ventaja de este método es la eliminación de la formación de gases tóxicos. Las desventajas son el consumo de una gran cantidad de KMnO4 y los tediosos procedimientos de tamizado, filtración, centrifugación y lavado. Por lo tanto, se han desarrollado varias tácticas para modificar el proceso de Hummers, como el empleo de ferrato de potasio (K2FeO4) como oxidante fuerte en lugar de KMnO4 y la eliminación del NaNO3 en la preparación del GO. [59,60,61]

El GO suele estar decorado con grupos funcionales de oxígeno, como carboxilo, hidroxilo y epóxido. Así, las láminas de GO son anfipáticas, ya que tienen componentes tanto hidrofílicos como hidrofóbicos. Se hidratan fácilmente al exponerse al agua debido a la presencia de grupos carboxilo en los bordes. Los grupos funcionales de oxígeno también permiten que el GO se disperse en varios disolventes orgánicos, como la acetona, el DCB, el NMP y el DMF. Además de los problemas mencionados, el proceso de Hummer sigue adoleciendo de ciertos defectos, como los problemas medioambientales relacionados con el uso de oxidantes fuertes y la introducción de impurezas en los productos de GO. Además, una gran cantidad de residuos de ácidos y agentes oxidantes puede conducir a la contaminación ambiental en la producción a gran escala de GOs en las industrias. [32,34,62,63]

En términos de salud, una cantidad mínima de Mn en los GOs derivados del permanganato potásico puede deteriorar sus propiedades físicas e inducir toxicidad en las células de mamíferos. En este sentido, la síntesis verde de GOs ha atraído una atención considerable en los últimos años, especialmente en el campo biomédico. El GO es un aislante eléctrico, y su conductividad puede recuperarse parcialmente mediante la reducción química en agentes reductores, como la hidracina y el borohidruro de sodio, para producir rGO. Hasta ahora, la hidracina sigue siendo el agente más utilizado debido a su fuerte actividad reductora para eliminar los grupos oxigenados. Sin embargo, la reducción química del GO a rGO no puede eliminar completamente los grupos oxigenados. En consecuencia, el rGO todavía contiene una cierta cantidad de grupos oxigenados residuales. Como alternativa, el calentamiento rápido del GO a 1050 °C bajo vacío o atmósfera inerte para generar TRG, de manera que los grupos funcionales oxigenados se eliminan como dióxido de carbono. [64-67]

Nanocompuestos de grafeno-polímero

El grafeno puro presenta un módulo elástico excepcionalmente alto, de aproximadamente 1 TPa, y una resistencia intrínseca de 130 GPa, una transparencia óptica superior de 97,7%, y una excelente conductividad eléctrica y movilidad de 2 × 105 cm2 V-1 s-1. En este sentido, el grafeno es un atractivo material de relleno de polímeros para formar nanocompuestos poliméricos funcionales. El rendimiento de los polímeros con alta flexibilidad puede adaptarse a aplicaciones específicas añadiendo rellenos de tamaño micro o nanoescalar. Los compuestos poliméricos heredan las propiedades ventajosas de sus componentes y, además, los polímeros proporcionan una matriz protectora para los rellenos incrustados frente a los daños mecánicos. Los microcompuestos poliméricos convencionales se utilizan habitualmente como componentes estructurales en los sectores biomédico e industrial debido a su peso ligero, su facilidad de fabricación y su bajo coste. Sin embargo, se necesitan contenidos de relleno de gran volumen (≥30%) para lograr los comportamientos biológicos, mecánicos y físicos deseados. Los grandes contenidos de volumen de relleno tienen efectos adversos en las propiedades de los microcompuestos poliméricos. En este sentido, los nanomateriales basados en el grafeno con bajas cargas de relleno pueden utilizarse para rellenar y reforzar polímeros. [8,9,68-70,71-76]

Como ya se ha dicho, el grafeno CVD prístino se desarrolla principalmente para dispositivos optoelectrónicos, pantallas táctiles y energía solar fotovoltaica. Las escamas de grafeno LPE contienen disolventes y tensioactivos residuales que tienen efectos adversos para la salud. En este sentido, los GO con grupos oxigenados se consideran rellenos ideales para reforzar polímeros. Estos grupos funcionales hacen que el GO sea hidrófilo, por lo que puede reaccionar con polímeros solubles en agua, como el alcohol polivinílico. Según la literatura, el módulo elástico de la monocapa de GO es de 207,6 ± 23,4 GPa, siendo una cuarta parte del módulo del grafeno puro. No obstante, el módulo del GO sigue siendo muy superior al de los biopolímeros, como el ácido poliláctico (PLA), con un módulo de unos 2,7-3 GPa, y la policaprolactona (PCL), de 0,4 GPa. Así pues, el GO puede utilizarse para reforzar los nanocompuestos de GO/PLA y GO/PCL con un mayor rendimiento mecánico, estabilidad térmica y biocompatibilidad. Estos biocompuestos poliméricos pueden prepararse por varias vías, como la mezcla en solución, la mezcla en fusión y el electrospinning. [77-81]

Viabilidad y toxicidad celular

Los nanomateriales basados en el grafeno pueden ser biocompatibles o tóxicos para las células biológicas. La respuesta de las células vivas a estos nanomateriales depende en gran medida de su número de capas, tamaño lateral, pureza, dosis, química superficial e hidrofilia. La química superficial de los nanomateriales de grafeno varía mucho debido a las diferentes estrategias adoptadas para su síntesis y a la disponibilidad de diferentes moléculas o polímeros para la funcionalización de la superficie. Por lo general, para la evaluación in vitro de la toxicidad de los nanomateriales se emplean varias líneas celulares principales, entre las que se encuentran los fagocitos (por ejemplo, macrófagos) y las células no fagocíticas (por ejemplo, células endoteliales y epiteliales, células cancerosas, eritrocitos, etc.). Comprender adecuadamente cómo interactúan los nanomateriales de grafeno con esas células es de crucial importancia para utilizarlos en aplicaciones médicas.

Las interacciones de los nanomateriales de grafeno con las membranas celulares también pueden provocar daños en la membrana y citotoxicidad. Los fosfolípidos de las membranas celulares están formados por un grupo principal de fosfato y dos cadenas de ácidos grasos. Los grupos principales incluyen colina, serina, glicerol, etanolamina, inositol y ácido fosfático. Los distintos grupos de cabeza de los fosfolípidos les confieren propiedades distintivas. Además, las membranas celulares también contienen moléculas de colesterol que desempeñan un importante papel en la estabilización de la estructura de la membrana, el mantenimiento de la fluidez y la modulación de las actividades de las proteínas asociadas a la membrana. El grafeno puro sin cargas en el plano basal no puede interactuar electrostáticamente con los fosfolípidos, pero favorece las interacciones hidrofóbicas con las colas de los lípidos. Además, las interacciones hidrofóbicas entre el grafeno puro y la cola de colesterol pueden extraer o eliminar las moléculas de colesterol de la membrana, lo que provoca daños en la misma.

Por ejemplo, Bernabo et al. indicaron que el GO puede interactuar con la membrana celular de espermatozoides porcinos, lo que provoca la extracción de colesterol de la membrana. A partir de la simulación teórica de sistemas de biomembranas, la extracción de la molécula de colesterol induce la formación de vacíos y la deformación de la membrana debido a las fuertes fuerzas de arrastre de la hoja de grafeno, lo que provoca una pérdida de la integridad de la membrana. Más recientemente, Duan et al. informaron de que el GO puede extraer fosfolípidos de las membranas celulares de las células epiteliales alveolares humanas A549 y de los macrófagos de ratón Raw264.7, produciendo poros en la superficie, tal y como evidencian las micrografías SEM. Este efecto redujo la viabilidad de las células, provocando su muerte final. Atribuyeron este hecho a las fuertes interacciones entre los dominios hidrofóbicos de los GOs y los carbonos de la cola de los lípidos sobre la base de simulaciones de dinámica molecular (MD). [82-84]

La carga superficial y la química de la superficie del GO ejercen efectos significativos en las interacciones celulares. El GO tiene una alta densidad de carga negativa conferida por los grupos funcionales oxigenados, por lo que pueden producirse posibles interacciones electrostáticas entre el GO y los lípidos de la membrana. En este contexto, Li et al. prepararon cinco lípidos con la misma cadena alquílica de 18 carbonos pero con diferentes cargas de los grupos principales, y estudiaron las interacciones entre el GO y los lípidos mediante la técnica de monocapa de Langmuir. Descubrieron que el GO puede interactuar con los grupos de cabeza de los lípidos cargados positivamente a través de interacciones electrostáticas, pero no con los lípidos cargados neutra o negativamente. Como es sabido, las cargas eléctricas de los fosfolípidos de las membranas celulares de los mamíferos son negativas o neutras. Es poco probable que los lípidos con carga negativa atraigan al GO de las mismas cargas. Hu et al. indicaron que los GO cargados negativamente sufren una repulsión electrostática con los lípidos de las mismas cargas, mientras que las interacciones hidrofóbicas entre los GO cargados negativamente y los lípidos facilitan la adsorción de los GO en los lípidos. Estos hallazgos indican que los GOs pueden inducir directamente daños en la membrana celular a través de interacciones hidrofóbicas sin penetrar en las células. Recientemente, Xia y sus colaboradores investigaron el efecto de la química de la superficie del GO en las interacciones de la membrana lipídica utilizando GO prístino, GO hidratado (hGO) y rGO. [85-87]

Informaron de que el hGO puede inducir la peroxidación lipídica de la membrana superficial, lo que conduce a la lisis de la membrana y a la destrucción de la integridad celular. El hGO se sintetizó haciendo reaccionar el GO con una solución de hidróxido de sodio a 50 o 100 °C. Durante el proceso de hidratación, los anillos epoxídicos del GO reaccionaron con los nucleófilos de la solución, creando grupos C-OH y radicales de carbono (*C), como se detectó mediante la técnica de resonancia paramagnética de electrones. Estos radicales eran reactivos debido a la presencia de electrones no apareados que reaccionaban fácilmente con el oxígeno para dar lugar a radicales superóxido, con capacidad para oxidar los lípidos insaturados y los grupos tiol de las proteínas para formar lipoperóxidos. Esto condujo a un fallo en la integridad de la membrana y a la muerte celular en los monocitos leucémicos humanos THP-1 y en las células del epitelio bronquial humano BEAS-2B. El grupo epoxi del GO puro también podía crear radicales de carbono, pero en menor medida que el hGO. Así, la citotoxicidad inducida por los materiales basados en GO en ambos tipos de células sigue el orden hGO > GO > rGO.

Además de las interacciones entre la membrana lipídica y el nanomaterial, los nanomateriales basados en el grafeno también pueden entrar en el citoplasma debido a su pequeño tamaño y a sus bordes afilados. Pueden penetrar fácilmente en la membrana celular, lo que provoca daños en la misma y la fuga del contenido citoplasmático. Al residir en las células vivas, pueden inducir toxicidad a través de la creación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que pueden causar trastornos mitocondriales al reducir el potencial de la membrana mitocondrial (MMP), y daños en la membrana celular a través de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). En este último caso, las ROS pueden inducir la peroxidación de los lípidos al reaccionar con los ácidos grasos insaturados de los lípidos de la membrana para producir peróxidos lipídicos, como el malondialdehído (MDA). A partir de estos resultados, el GO puede inducir la generación de ROS extracelulares e intracelulares, incluso a dosis bajas, de manera dependiente de la dosis y del tiempo.

Por lo tanto, la producción de ROS, la disfunción mitocondrial y la fuga de LDH son los factores clave relacionados con la muerte celular, como en el caso de los queratinocitos humanos de la piel HaCaT. Si los nanomateriales pueden entrar en el núcleo, podrían interactuar directamente con el ADN y causar genotoxicidad. Además, las condiciones in vitro e in vivo, como la dosis de grafeno, el tiempo de exposición, el tipo de célula o animal y la técnica utilizada para evaluar la viabilidad celular pueden influir en la biocompatibilidad y el efecto tóxico de los nanomateriales de grafeno. Por lo tanto, es necesario comprender adecuadamente las interacciones de los nanomateriales basados en el grafeno con los sistemas biológicos y sus efectos adversos para seguir desarrollando y utilizando estos nanomateriales de forma segura. [88]

Cultivo celular in vitro

Grafeno cultivado por CVD

El uso de grafeno prístino nos permite comprender mejor la respuesta directa y la interacción entre el grafeno nanoestructurado y las células biológicas. En la bibliografía se han comunicado resultados contradictorios sobre los efectos de las películas de grafeno puro en la biocompatibilidad y la citotoxicidad de los sistemas celulares. Zhang et al. expusieron grafeno cultivado mediante CVD con dosis de 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 µg/mL a células neuronales PC12 durante 1, 4 y 24 h. A la dosis más baja de 0,01 µg/mL, el grafeno no tuvo ningún efecto sobre la actividad metabólica, la liberación de LDH y las ROS. A una dosis alta de 10 µg/mL, el grafeno indujo efectos citotóxicos al disminuir la actividad mitocondrial según los resultados del ensayo con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), mientras que aumentaron los niveles de ROS, caspasa-3 y LDH. A partir del ensayo de la caspasa 3 (marcador de apoptosis), la apoptosis se produjo a dosis de grafeno ≥10 µg/mL. [89-95]

Así, los efectos citotóxicos inducidos por el grafeno fueron dependientes de la dosis y del tiempo. En general, se sabe que las ERO pueden oxidar las moléculas de lípidos, proteínas y ADN de las células, lo que influye en la señalización y el metabolismo celulares. El aumento de la producción de ROS puede causar la despolarización de la membrana mitocondrial y promover la activación de las caspasas. La despolarización de la membrana mitocondrial es el resultado de una pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial, lo que provoca una disminución de la MMP. Esto, a su vez, retrasa la síntesis de ATP a partir de la mitocondria, que es la central de energía de la célula. Las caspasas son proteasas intercelulares responsables del corte proteolítico. La caspasa 3 es la principal caspasa que participa en la ejecución de la apoptosis.

Por el contrario, Nayak et al. descubrieron que las películas de grafeno cultivadas mediante CVD no dificultan la proliferación de las células madre mesenquimales humanas (hMSC), sino que aceleran su diferenciación específica en células óseas. Investigaron el efecto del grafeno en la proliferación de las hMSCs empleando cuatro materiales de sustrato con diferente rigidez y rugosidad superficial, incluyendo polidimetilsiloxano (PDMS), PET, portaobjetos de vidrio y SiO2/Si. Todas las muestras de sustrato recubiertas de grafeno muestran un gran aumento de los depósitos de calcio debido a la formación de hueso. Además, los resultados del ensayo MTT y las imágenes de inmunofluorescencia revelan una buena viabilidad y morfología celular. [90]

Kim et al. también demostraron que las películas de grafeno cultivadas mediante CVD presentan una adhesión celular estable y una excelente biocompatibilidad con células cardíacas adultas primarias (cardiomiocitos). Las películas de grafeno con una conductividad eléctrica superior son especialmente adecuadas para la adhesión de células neuronales, ya que sus funciones están asociadas a actividades eléctricas. A este respecto, Park et al. informaron de la mejora de la diferenciación de células madre neurales humanas en neuronas sobre el sustrato de vidrio recubierto de grafeno. [91,92]

La migración y la adhesión celular están coordinadas por grandes complejos proteicos conocidos generalmente como adhesiones focales (AF). Las AF contienen altos niveles de vinculina, talina, paxilina, α-actinina, quinasa de adhesión focal, etc. La proteína vinculina, en particular, controla la adhesión celular. Une los filamentos de actina a la matriz extracelular (MEC), a través de la talina y de las proteínas transmembrana integrinas. Las integrinas desempeñan un papel clave en la convergencia de señales desde la membrana celular hacia el interior de la célula. Se considera que la topografía a nanoescala de los sustratos artificiales puede regular las AF y su adhesión, proliferación y diferenciación celular asociadas. Recientemente, Lasocka et al. estudiaron la adhesión y proliferación de fibroblastos de ratón L929 sobre una película de grafeno cultivada mediante CVD. Indicaron que la película de grafeno no presenta citotoxicidad para los fibroblastos L929. Además, la película de grafeno nanoestructurada aumenta la adhesión celular a las 24 horas de cultivo (Figura 5). A partir de las imágenes de inmunofluorescencia, pueden observarse fibras de tensión de vinculina y actina en los fibroblastos que crecen tanto en la película de grafeno como en el sustrato de vidrio. [93-95]

Las células sobre la lámina de grafeno muestran una mayor expresión de vinculina en términos de número de adhesiones focales. En particular, las fibras de estrés de actina son más aparentes y evidentes en los fibroblastos que crecen sobre el grafeno. Las fibras de tensión se componen generalmente de haces de filamentos de F-actina (proteína del citoesqueleto), que están reticulados entre sí por la α-actinina. Parece que el grafeno nanoestructurado promueve la expresión de las FAs regulando la expresión de la vinculina, lo que mejora la adhesión celular. Lasocka et al. también emplearon el ensayo colorimétrico CCK-8 para evaluar la viabilidad de las células y la proliferación, y descubrieron que la actividad mitocondrial de L929 era aproximadamente 12% mayor que la de una muestra de vidrio de control (Figura 6). El CCK-8 contiene una sal de tetrazolio, WST-8, compuesta por [2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfophenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica], que se reduce a formazán soluble en agua por las deshidrogenasas celulares. La cantidad de formazán producida es directamente proporcional al número de células vivas. La sensibilidad de detección del CCK-8 es mayor que la de otras sales de tetrazolio, como el MTT y el WST-1.

Figur 5
Figura 5 Inmunoetiquetado de las células L929 cultivadas durante 24 horas en el vidrio (control) y en la monocapa de grafeno prístina: faloidina-FITC para el citoesqueleto de actina (verde), anticuerpo anti-vinculina para la vinculina (rojo) y tinción Hoechst 33342 para el ADN (azul). Las flechas blancas indican las fibras de estrés de actina (panel izquierdo) y la proteína de adhesión focal-vinculina (panel central). Reproducido de [95] con permiso de Elsevier.
Figur 6
Figura 6 Actividad mitocondrial (ensayo CCK-8) de los fibroblastos L929 cultivados en los sustratos de vidrio y grafeno. Los datos se representan como media ± SD (desviación estándar) de tres experimentos independientes. ** p < 0.01. Reproducido de [95] con permiso de Elsevier.

Más recientemente, Rastogi et al. estudiaron el efecto de las películas de grafeno cultivadas mediante LPCVD sobre la viabilidad y el estrés celular de células no neuronales (fibroblastos renales de mono; Cos-7) y neuronales (neuronas del hipocampo de rata). Informaron de que el grafeno mejora la adhesión celular y el crecimiento de ambas líneas celulares. Además, el grafeno no muestra ningún efecto perjudicial sobre el MMP y la morfología de ambos tipos de células, lo que demuestra que el grafeno prístino no induce estrés celular. En su estudio se adoptó el ensayo de vida-muerte y el de éster etílico de tetrametilrhodamina (TMRE). El TMRE es un marcador cuantitativo de fluorescencia para la actividad mitocondrial. [96]

El ensayo vivo-muerto es una prueba de viabilidad celular fluorescente para evaluar las células vivas y muertas basada en la detección de la integridad de la membrana y las consecuencias citotóxicas. Las membranas de las células viables están intactas y herméticas, pero las membranas de las células muertas están alteradas o dañadas. La prueba emplea los colorantes acetoximetil de calceína (Calcein-AM) y homodímero de etidio para teñir las células vivas y muertas, respectivamente. La calceína-AM tiñe de verde las células vivas, mientras que el EthD-III tiñe de rojo las células muertas. La calceína AM es un compuesto no fluorescente y se convierte en calceína verde fluorescente debido a la reacción de hidrólisis por parte de las esterasas intracelulares en las células vivas. La figura 7 muestra los resultados del ensayo de vida-muerte de las células Cos-7 cultivadas sobre grafeno prístino y vidrio (control) durante diferentes períodos. Aparentemente, las películas de grafeno no presentan efectos citotóxicos detectables sobre la viabilidad celular. Las películas promueven la adhesión y el crecimiento de las células, especialmente a las 96 h (Figura 7C (II)).

Figur 7
Figura 7 Ensayo de vida-muerte de las células Cos-7 cultivadas sobre (I) vidrio y (II) grafeno durante (A) 24 h, (B) 48 h y (C) 96 h. El verde, el rojo y el azul denotan células vivas, células muertas y núcleos celulares, respectivamente. Barras de escala: 100 μm. (D) número de células y (E) viabilidad % de las células Cos-7 cultivadas en el vidrio (naranja) y en el grafeno (verde) durante 24, 48 y 96 h, respectivamente. * y ** denotan p < 0,05 y p < 0,005, respectivamente. NS indica que no hay diferencias estadísticamente significativas. Reproducido de [96] con permiso de la American Chemical Society.

En los últimos años, el titanio y sus aleaciones se han utilizado cada vez más para fabricar implantes dentales. Las aleaciones con base de Ti suelen presentar una resistencia a la corrosión mucho mayor que las aleaciones inoxidables. Sin embargo, los metales con base de Ti sufren una gran pérdida por desgaste durante su vida útil dentro de la cavidad oral. Se sabe que la modificación de la superficie de los implantes dentales con recubrimientos duros es muy eficaz para combatir el problema del desgaste y la acumulación de placa dental bacteriana en los implantes. En este sentido, la película de grafeno inerte con alta dureza es un material atractivo para el recubrimiento de implantes dentales.

Así, la película de grafeno CVD sintetizada puede transferirse a un sustrato metálico de Ti para mejorar su resistencia al desgaste y su propiedad bactericida. Zhou y sus colaboradores investigaron la adhesión, la proliferación y la diferenciación osteogénica de las células madre humanas derivadas del tejido adiposo (hASCs) y de las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) in vitro e in vivo al exponerlas a discos de Ti recubiertos de CVD-grafeno. Para la prueba in vivo, se implantaron discos de CVD-grafeno/Ti en la zona subcutánea de la espalda de ratones desnudos. Sus resultados indicaron que el grafeno prístino promueve la diferenciación osteogénica de las hASC y las hMSC in vitro e in vivo. [97-100]

Óxido de grafeno y sus derivados

Óxido de grafeno

Se han realizado amplios estudios sobre la biocompatibilidad/citotoxicidad de los GO debido a su facilidad de fabricación y a su coste relativamente bajo. El GO puede aumentar la viabilidad de las células y causar su muerte dependiendo del tamaño, la dosis, el tiempo, el tipo de célula y la química de la superficie. Debido a los diferentes estados de oxidación de la superficie y a las características entre el GO, el rGO y el TRG, estos materiales de grafeno tienen propiedades químicas y físicas distintas. El GO posee muchos defectos, como vacantes debidas a la síntesis, como revelan las imágenes TEM de alta resolución y los espectros Raman. El TRG producido a partir del calentamiento rápido del GO a altas temperaturas presenta una característica arrugada. [31,32,67]

Los investigadores suelen utilizar el proceso de Hummers modificado para oxidar el grafito. Sin embargo, se han empleado diversos tiempos y temperaturas de oxidación, así como diferentes tipos y concentraciones de oxidantes para sintetizar GOs. En consecuencia, los GOs resultantes contienen diferentes contenidos de O o relaciones O/C. Las relaciones O/C en los GOs afectan en gran medida a sus propiedades estructurales, como se manifiesta en el grado de exfoliación, el número de capas de grafeno, el grosor y el tamaño de las capas laterales, la fracción defectuosa, la concentración de grupos funcionales, etc. En consecuencia, los GOs con distintos niveles de oxidación e impurezas interactuarían de forma diferente al ser expuestos a la misma línea celular. La diversidad estructural de los GOs conduce a resultados contradictorios en la literatura en relación con la biocompatibilidad y la toxicidad. Por lo tanto, parece necesario estandarizar el proceso de síntesis en el uso de GOs para aplicaciones biomédicas. [59,60,61]

La síntesis del GO generalmente implica el uso de varios oxidantes fuertes que pueden introducir impurezas o contaminantes residuales en los productos finales. Wong et al. determinaron los tipos y contenidos de impurezas en el GO y el rGO. Informaron de que los pasos de oxidación y reducción química durante la fabricación pueden introducir varios elementos metálicos en el GO y el rGO. Las principales impurezas eran el manganeso (unas 2.290 ppm), el potasio (820 ppm), el sodio (96 ppm) y el Fe (82 ppm). Estas impurezas procedían del ácido sulfúrico, el nitrato de sodio y los reactivos de permanganato de potasio. Otras impurezas metálicas detectables eran Ca, Co, Cr, Cu, Ni, Pb y Zn. Además, los agentes reductores hidracina y borohidruro de sodio (NaBH4) provocaron mayores concentraciones de Fe y Na en el rGO. Los niveles de Fe y Na aumentaron de 82 a 123 y 7600 ppm, respectivamente, al reducirse con NaBH4. Las impurezas residuales de Mn y Fe en el GO afectaron notablemente a sus propiedades físicas. [101]

Los metales pesados, como el Mn, el Fe y el Cr, son especialmente perjudiciales o tóxicos para las células de los mamíferos. El manganeso puede inducir toxicidad en las células pulmonares y nerviosas, y causar trastornos mitocondriales al disminuir la MMP e inhibir la activación del Ca2+ mediante el control de la tasa de síntesis de ATP durante la fosforilación oxidativa. Así, la presencia de Mn en el núcleo de las células PC12 puede provocar la condensación de la cromatina, la fragmentación del ADN y el aumento de los niveles de ARNm de la caspasa-3. El Mn también puede atravesar la barrera hematoencefálica y entrar en el cerebro. Tras la exposición al cuerpo humano, los efectos tóxicos del manganeso se encuentran principalmente en el tracto respiratorio y en los tejidos cerebrales, incluyendo embolia pulmonar, bronquitis y daños nerviosos. [93, 102,103]

Se ha informado de que los nanotubos de carbono de pared simple con trazas de Co, Cr, Fe, Ca y Si son más tóxicos que el GO sin impurezas (sintetizado por vía electroquímica) expuesto en las mismas líneas celulares. Cabe destacar que los agentes químicos, como la hidracina anhidra, el monohidrato de hidracina y el borohidruro de sodio, que se suelen emplear para reducir el GO, son muy tóxicos para los seres humanos. Estos productos químicos deben evitarse para preparar el rGO utilizado para la manipulación celular. En su lugar, se pueden utilizar como agentes reductores productos naturales respetuosos con el medio ambiente, como la glucosa, el polifenol del té y el ácido ascórbico. En los últimos años, se han realizado esfuerzos para sintetizar el rGO utilizando extractos respetuosos con el medio ambiente derivados de plantas naturales, como el hongo, la hoja de palma y el aloe vera. Por ejemplo, Dasgupta et al. redujeron con éxito el GO en solución acuosa con polisacáridos extraídos de un hongo silvestre comestible. Informaron de que el rGO era biológicamente seguro en concentraciones inferiores a 100 μg/mL. [65,104,105,106]

Chang et al. estudiaron el efecto del tamaño y la dosis en la biocompatibilidad del GO expuesto a células A549. En su trabajo se utilizaron GOs con tamaños de 780 ± 410 nm (l-GO), 430 ± 300 nm (m-GO) y 160 ± 90 nm (s-GO). El GO mostró una buena biocompatibilidad con las células A549 y no mostró signos de citotoxicidad (Figura 8). El ensayo CCK-8 demostró que el efecto de l-GO y m-GO sobre la viabilidad de las células A549 era pequeño. Las células mantuvieron un alto nivel de viabilidad (más de 80%), incluso a una alta concentración de GO de 200 µg/mL. Sin embargo, se observó una pérdida de viabilidad para el s-GO a 200 µg/mL. A esta dosis, la viabilidad celular fue de 67% durante 24 h de incubación. Además, se empleó el ensayo de exclusión con azul Trypan, en el que las células muertas se tiñeron de azul y las vivas permanecieron inalteradas, para evaluar la mortalidad celular. Las células vivas suelen presentar membranas celulares intactas; el azul tripán no puede atravesar sus membranas y entrar en el citoplasma. Por el contrario, el colorante penetra la membrana celular porosa y entra en el citoplasma de las células muertas. Aunque la s-GO induce una pérdida de viabilidad a 200 µg/mL, no se encuentra un aumento de la mortalidad de las células A549. La mortalidad se mantiene a 1,5%, siendo similar a la del control (1,4%) (Figura 9). Utilizando TEM, tampoco se encuentra captación celular de GO por parte de las células A549. Del mismo modo, Bengtson et al. también informaron de que el GO y el rGO de diferentes tamaños no inducen toxicidad en la línea celular epitelial pulmonar murina. [44,46]

Figur 8
Figura 8 Efectos de las dosis y tamaños de óxido de grafeno (GO) sobre la viabilidad de las células A549. Reproducido de [46] con permiso de Elsevier. * y ** denotan p < 0,05 y p < 0,01 frente al control, respectivamente.
Figur 9
Figura 9 Los efectos de las dosis y tamaños de GO en la mortalidad de las células A549. Reproducido de [46] con permiso de Elsevier.

Según la literatura, los GOs muestran una toxicidad dependiente de la dosis y del tamaño hacia diferentes líneas celulares, por ejemplo, fibroblastos humanos, carcinoma hepatocelular humano, queratinocitos de la piel humana, etc. Wang et al. demostraron que los GO con dosis 50 μg/mL causan citotoxicidad al inducir la apoptosis celular. Atribuyeron la citotoxicidad a la penetración de los GOs en los lisosomas, la mitocondria, el endoplasma y el núcleo celular. Lammel et al. estudiaron el efecto de la exposición de células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) a los GO, con dosis de 1, 2, 4, 8 y 16 µg/mL. Se encontró citotoxicidad dependiente de la dosis y del tiempo en las células HepG2, incluso a una concentración baja de 4 µg/mL. La toxicidad inducida por el GO surgió de una pérdida de la integridad estructural de la membrana plasmática y una disminución de la MMP, debido a una fuerte interacción física del GO con la bicapa de fosfolípidos. A continuación, el GO penetró en el citosol a través de la membrana plasmática, generando ROS y provocando un aumento del número de células apoptóticas. Muy recientemente, Bernabo et al. evaluaron la viabilidad de espermatozoides porcinos exponiéndolos a 0,5-50 µg/mL de GO durante 1 a 4 h. La muerte celular se produjo a dosis de GO ≥10 µg/mL tras 1 h de exposición. A dosis más bajas de GO, se extrajo el colesterol de la membrana de los espermatozoides, lo que provocó el daño de la membrana. [43,47,82,87,88]

Ahora se estudian los efectos de los GOs en la biocompatibilidad/toxicidad de las células inmunitarias. Las interacciones de los GOs con los sistemas inmunológico y circulatorio son cruciales; una vez administrados, entran directamente en contacto con dichos sistemas. Los macrófagos son las células que participan en el mecanismo de defensa del sistema inmunitario innato y proporcionan una primera línea de defensa contra los microorganismos. Los macrófagos se originan en los monocitos de la médula ósea que migran a través de la circulación sanguínea. En presencia de bacterias y objetos extraños, los macrófagos activados secretan citocinas y quimiocinas para atraer a las células con receptores de quimiocinas, como los neutrófilos y los monocitos del torrente sanguíneo. Se han realizado varios estudios sobre los macrófagos que actúan como células objetivo de los GO. El grafeno prístino y los GOs inducen la formación de varias citoquinas proinflamatorias, como la IL-1α, la IL-6, la IL-10 y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), y de quimiocinas, como la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), la proteína inflamatoria de macrófagos-1α (MIP-1α) y el MIP-1β tras la activación de los macrófagos. Es bien sabido que los macrófagos presentan un comportamiento fagocítico, que conduce a un mecanismo de internalización. En este sentido, los GOs pueden ser internalizados por los macrófagos, dando lugar a la inflamación. Russier et al. informaron de que la capacidad fagocítica de los macrófagos depende del tamaño de las escamas de GO. [107-111]

Los macrófagos tienen mayor capacidad para internalizar las GOs más pequeñas que las grandes. Del mismo modo, Ma et al. demostraron que los macrófagos murinos J774A.1 internalizan fácilmente los GOs pequeños con tamaños laterales de 50-350 nm, mientras que los GOs grandes (750-1300 nm) se adsorben preferentemente en sus membranas plasmáticas, desencadenando así las vías del receptor tipo Toll (TRL) y del factor nuclear NF-κB para promover la proinflamación. Los GOs grandes tienen más probabilidades de interactuar con la membrana celular debido a sus grandes áreas de superficie. Recientemente, Mendes et al. investigaron el efecto del tamaño de los GOs sobre la viabilidad/toxicidad de los macrófagos y las células HeLa de cáncer de cuello de útero (Figura 10). En su estudio utilizaron GOs con un tamaño medio de 89 y 277 nm. Encontraron que las escamas de GO grandes inducen niveles de toxicidad más altos que las escamas pequeñas, especialmente a un tiempo de incubación más largo de 48 h (Figura 11). El examen TEM reveló que los GOs de diferentes tamaños son internalizados por los macrófagos (Figura 12) y las células HeLa a las 12 y 48 h de incubación. En particular, los macrófagos experimentaron un cambio morfológico para la fagocitosis después del cultivo durante 48 h, independientemente de los tamaños. Este cambio morfológico condujo a la formación de grandes vacuolas que contenían GOs. [110,111]

FIgur 10
Figura 10 Esquema que muestra las estrategias utilizadas para evaluar la citotoxicidad dependiente del tamaño y la internalización del óxido de nanografeno (ONG). Reproducido de [111] con permiso de la Royal Society of Chemistry.
Figur 11
Figura 11 (a,c) son los resultados del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) de células HeLa cultivadas con GOs de diferentes tamaños y dosis durante 12 h y 48 h, respectivamente. (b,d) son resultados de MTT de macrófagos cultivados con GOs de diferentes tamaños y dosis durante 12 h y 48 h, respectivamente. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p 0,05 no significativa. Reproducido de [111] con permiso de la Royal Society of Chemistry.
Figur 12
Figura 12 (a,b) son imágenes TEM de un macrófago cultivado con GOs pequeños durante 12 y 48 h, respectivamente. (c,d) son imágenes TEM de un macrófago cultivado con GOs grandes durante 12 y 48 h, respectivamente. Escamas de GO con tamaños de 89 y 277 nm son internalizadas por un macrófago, como indican las flechas. Reproducido de [111] con permiso de la Royal Society of Chemistry.

Como ya se ha mencionado, los GOs pueden interactuar con las membranas celulares e inducen daños mediante la formación de ROS, la extracción de lípidos o colesteroles de la membrana y la generación de radicales de carbono. Los glóbulos rojos (eritrocitos) generalmente carecen de capacidad de reparación debido a la ausencia de núcleo y mitocondrias. El daño de la membrana del eritrocito se denomina hemólisis. Xia y sus colaboradores indicaron que la peroxidación lipídica podía provocar un fallo en la integridad de la membrana de los eritrocitos murinos. El GO hidratado indujo una hemólisis más grave que el GO y el rGO. Liao et al. informaron de que los GOs (765 ± 19 nm) activaban la actividad hemolítica de los eritrocitos humanos. Los GOs sonorizados de menor tamaño (342 ± 17 nm) mostraron una mayor tasa de hemólisis que los GOs grandes. Sin embargo, el recubrimiento de los GOs con quitosano casi eliminó la actividad hemolítica. Por lo tanto, los modos de interacción de los GOs con las células (es decir, las células en suspensión frente a las adherentes) afectan a la viabilidad de los eritrocitos. Recientemente, Papi et al. también indicaron que la actividad hemolítica de los eritrocitos humanos aumenta al reducirse el tamaño de las GO. Esta actividad era insignificante cuando la corona de proteínas plasmáticas estaba adsorbida en las superficies de los GO. [45,87,112]

Aparte de las interacciones entre los GO y los eritrocitos, se dispone de poca información en la literatura sobre el efecto tóxico de los GO en las células primarias humanas. Las células primarias se obtienen directamente de tejidos vivos y se establecen para su crecimiento in vitro. Imitan el estado fisiológico de las células in vivo y producen resultados más útiles que representan el sistema del cuerpo humano. Se necesita un permiso ético para la adquisición de células primarias humanas de órganos de tejidos sanos y enfermos. Recientemente, Wu et al. evaluaron la toxicidad de los GOs al exponerlos a células primarias del epitelio de la córnea humana (hCorECs) y a células del epitelio de la conjuntiva humana (hConECs) con dosis de 12,5-100 µg/mL. A partir de los datos del ensayo WST-8, las GOs no inducen citotoxicidad a las hCorECs a las 2 h (Figura 13A), con la excepción del aumento de la necrosis sobre la base de la detección de apoptosis por citometría de flujo a 50 µg/mL (Figura 13C).

Sin embargo, los GOs causan una citotoxicidad significativa a las hCorECs después de 24 h. La viabilidad celular disminuye notablemente con el aumento de las dosis de GO (Figura 13B). A 50 µg/mL de GO, la citometría de flujo revela un aumento significativo de células apoptóticas (Figura 13D). En el caso de las hConECs, el ensayo WST-8 indica que casi 40% de las hConECs están muertas al cultivarlas con 12,5 µg/mL de GO durante 24 h. La viabilidad celular es sólo de 50% a medida que la concentración de GO aumenta hasta 100 µg/mL (Figura 14A). A 50 µg/mL de GO, la citometría de flujo indica que el porcentaje de células normales desciende significativamente, mientras que el porcentaje de células de necrosis aumenta notablemente tras 24 h de exposición (Figura 14B). Concluyeron que los GOs inducen una citotoxicidad dependiente de la dosis y del tiempo tanto en las hCorECs como en las hConECs a través de la generación de estrés oxidativo a partir de la detección de ROS. [113]

Figur 13
Figura 13 Resultados del ensayo WST-8 para células del epitelio corneal humano (hCorECs) expuestas a GOs de varias dosis durante (A) 2 h y (B) 24 h, respectivamente. Análisis de citometría de flujo de apoptosis de hCorECs expuestas a GO (50 µg/mL) durante (C) 2 h y (D) 24 h, respectivamente. Se realizaron tres experimentos independientes para ambos ensayos. Los datos se presentan como media ± SEM (error estándar de la media). El * denota p < 0,05 y el ** representa p < 0,01. Reproducido de [113] con permiso de Taylor & Francis.
Figur 14
Figura 14 (A) Ensayo WST-8 para hConECs expuestas a GOs de diferentes dosis durante 24 h. (B) Análisis de citometría de flujo de apoptosis de hConECs expuestas a GO (50 µg/mL) durante 24 h. Se realizaron tres experimentos independientes para ambos ensayos. Los datos se presentan como media ± SEM. El * denota p < 0,05 y el ** representa p < 0,01. Reproducido de [113] con permiso de Taylor & Francis.
PEGilación

Los óxidos de grafeno pueden ser funcionalizados con una variedad de moléculas y biomoléculas para aumentar su dispersabilidad en soluciones fisiológicas, mejorando así su biocompatibilidad. Los GO se suelen funcionalizar con PEG, amina, ácido acrílico y dextrano. En particular, se ha demostrado que el GO-PEG presenta una buena biocompatibilidad en comparación con el GO . Wojtoniszak et al. informaron de que el GO PEGilado muestra la mejor biocompatibilidad con la línea celular de fibroblastos de ratón (L929) en dosis de 3,125-12,5 µg/mL. La viabilidad celular relativa es superior a 80% en este rango de dosis. Al aumentar la dosis a 50 µg/mL, la viabilidad celular desciende notablemente a unos 60%, es decir, unas 40% células están muertas. Du et al. trataron el GO-PEG con células de linfoma y estudiaron la viabilidad celular mediante el ensayo CCK-8. [48,114,115]

Las células que fueron tratadas con GO-PEG (10-100 μg/mL) durante 24 h tuvieron tasas de viabilidad superiores a 80%, lo que implica una baja citotoxicidad y una alta biocompatibilidad del PEG-GO. Por el contrario, se informó de que las láminas de GO con PEgiladas mostraban citotoxicidad para algunas líneas celulares. Por ejemplo, se descubrió que las láminas de GO-PEG interrumpían los filamentos de F-actina de los osteoblastos de osteosarcoma humano Saos-2, los preosteoblastos MC3T3-E1 y los macrófagos RAW-264.7 tras su internalización. Estos filamentos eran necesarios para regular la migración celular. La interrupción indujo alteraciones del ciclo celular, apoptosis y estrés oxidativo en estas líneas celulares. Recientemente, Mendonca et al. indicaron que el rGO-PEG induce un exceso de ROS en los astrocitos murinos a 100 µg/mL, reduciendo la viabilidad celular a sólo 16% después de 24 de exposición. Luo et al. demostraron que las láminas de GO PEGiladas inducían una respuesta inmunitaria en los macrófagos peritoneales a través de la secreción de citoquinas para potenciar las vías de señalización relacionadas con la integrina beta-8. Por lo tanto, la PEGilación no actuó para pasivar las superficies de los materiales basados en grafeno. [116,117,118]

Más recientemente, Xu et al. estudiaron la viabilidad de los macrófagos murinos (J774A.1) tratados con GO, GO-NH2, GO funcionalizado con poli(acrilamida) (GO-PAM), GO funcionalizado con poli(ácido acrílico) (GO-PAA) y GO-PEG in vitro e in vivo. Entre ellos, el GO-PEG y el GO-PAA resultaron ser menos tóxicos que el GO, y el GO-PAA mostró la mejor compatibilidad in vitro (Figura 15) e in vivo. Atribuyeron las variaciones a las composiciones diferenciales de las coronas de proteínas, en particular de la inmunoglobulina G (IgG), que se forman en sus superficies y que dictan sus interacciones con la membrana celular y la captación celular. Como es sabido, las proteínas cubren rápidamente las superficies de los nanomateriales cuando éstos entran en contacto con un entorno fisiológico. Esta capa de proteínas adsorbidas suele denominarse corona proteica. En un trabajo reciente realizado por Syama et al., se comprobó que el rGO-PEG (PrGO) no presentaba toxicidad en las células madre mesenquimales (MSC) de médula ósea de ratón, y no parecía perjudicar su diferenciación. El PrGO se preparó reduciendo el GO-PEG con borohidruro de sodio. [119,120]

La PrGO fue internalizada por las MSC y distribuida por todo el citoplasma. Aunque también indujo la generación de ROS en el interior de la célula, no se detectó ningún cambio en la proliferación o función celular. En otro estudio, la PrGO mostró una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad de las células epiteliales alveolares A549 tras 24 horas de exposición. Las dosis oscilaron entre 1-200 μg/mL. El ensayo MTT reveló que más de 80% de las células eran viables a 10 μg/m, pero la viabilidad cayó por debajo de 76% a 25 μg/mL después de 24 h. El ensayo de captación de rojo neural (NRU) también mostró una tendencia de disminución similar en la viabilidad celular dependiente de la dosis.

Además, la PrGO indujo un aumento de ROS dependiente de la dosis y del tiempo, redujo las MMP y desencadenó una respuesta inflamatoria tras su internalización, lo que condujo a la apoptosis. Por lo tanto, las MSC y las líneas celulares A549 respondieron de forma diferente a la PrGO preparada a partir de los mismos procedimientos. En cambio, el rGO no fue internalizado por las células A549, sino que se adhirió a la membrana plasmática. Como tal, activó el NF-κB al unirse a los TLR de la superficie celular y desencadenó la respuesta inflamatoria correspondiente. [121]

Figur 15
Figura 15 Resultados del ensayo CCK-8 de células de macrófagos (J774A.1) tratadas con GO, GO-NH2, GO funcionalizado con poli(acrilamida) (GO-PAM), GO funcionalizado con poli(ácido acrílico) (GO-PAA) y poli(acrilamida)-polietilenglicol (GO-PEG) a diferentes concentraciones durante 24 h (n = 5). Reproducido de [119] con permiso de The American Chemical Society.
Óxido de grafeno reducido

Akhavan et al. prepararon nanoplaquetas de rGO mediante la sonicación de láminas de GO pEGiladas, seguida de una reducción en hidracina y albúmina de suero bovino. La prueba de viabilidad celular reveló destrucciones celulares significativas en hMSCs al tratarlas con sólo 1,0 μg/mL de rGO. Las nanoplaquetas de rGO indujeron efectos genotóxicos en las células mediante la fragmentación del ADN y la aberración cromosómica. Como se mencionó anteriormente, la hidracina es altamente tóxica y explosiva, por lo que un efecto tóxico significativo puede provenir de la hidracina residual en la superficie del rGO. Para las aplicaciones biomédicas, se considera necesario considerar los efectos tóxicos de los disolventes y agentes reductores empleados para exfoliar las láminas de grafeno. Muchos de estos reactivos químicos no cumplen las normas de seguridad. Wu et al. han demostrado recientemente que el rGO es más tóxico que el GO al exponerlo a macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) y a la línea celular J774A.1. En su estudio, el rGO provocó mayores niveles de citoquinas proinflamatorias, es decir, TNF-α e IL-6 en los macrófagos, particularmente en los BMDM. Atribuyeron esto a que el rGO induce un mayor estrés oxidativo en los macrófagos en comparación con el GO. Cabe destacar que emplearon sulfuro de sodio (Na2S) para reducir el GO. El sulfuro de sodio es un agente tóxico que provoca graves irritaciones o quemaduras en la piel humana, y reacciona con el aire húmedo o el ácido para producir H2S tóxico. Consideramos que el Na2S residual en el rGO induce citoquinas proinflamatorias, lo que conduce a la activación de los macrófagos. [122,123]

Para hacer frente a la citotoxicidad inducida por la hidracina, Gurunathan et al. prepararon con éxito el RGO utilizando una cepa bacteriana, es decir, Pseudomonas aeruginosa, como reactivo reductor del GO. A continuación, expusieron los fibroblastos embrionarios primarios de ratón (PMEF) al GO prístino, al GO reducido microbiológicamente (M-rGO) y al GO reducido con hidracina (H-rGO) en diferentes concentraciones. Los resultados del ensayo WST-8 indicaron que la viabilidad celular se mantiene en aproximadamente 91,0 ± 2,0% al tratar los PMEF con 20-100 μg/mL de M-rGO (Figura 16a). Sin embargo, el H-rGO muestra un nivel significativo de toxicidad en comparación con el M-rGO. La viabilidad celular cae por debajo de 60% al tratar con 20 μg/mL de H-rGO. Los datos del ensayo de azul tripán también revelaron que la mortalidad celular se mantiene en unos 4% al tratar con un nivel alto de M-rGO (100 μg/mL), siendo la misma que la del control (Figura 16b). Por el contrario, el H-rGO induce la mayor tasa de muerte cuando se compara con el M-rGO. Sus resultados demuestran claramente el efecto tóxico de la hidracina para las células biológicas. Aunque la biomasa bacteriana puede reducir el GO y minimizar el efecto tóxico del rGO con eficacia, su uso es muy limitado para el campo biomédico. Esto se debe a que Pseudomonas aeruginosa puede causar infecciones del tracto urinario y respiratorio, neumonía y enfermedades de dermatitis. [124]

Figur 16
Figura 16 (a) Ensayo WST-8 para fibroblastos embrionarios primarios de ratón expuestos a GO, M-rGO y H-rGO de diferentes concentraciones durante 24 h. Las barras de error representan el error estándar de la media (n = 3); p < 0,05; (b) Mortalidad celular de células de fibroblastos embrionarios primarios de ratón (PMEF) determinada a partir del ensayo de azul tripán tras la exposición durante 24 h a GO, M-rGO y H-rGO de diferentes concentraciones. Las barras de error representan el error estándar de la media (n = 3); p < 0,05. Reproducido de [124] con permiso de Elsevier.

Más recientemente, Dasgupta et al. utilizaron rGOs sintetizados en verde en diferentes dosis (50, 100 y 250 µg/mL) para investigar sus interacciones con linfocitos humanos derivados de muestras de sangre fresca. Los GOs se redujeron en una solución de extracto de hongos silvestres para producir rGOs. Se utilizaron varios ensayos, incluyendo MTT, captación de rojo neural, citometría de flujo y ROS para las pruebas celulares in vitro. Los datos del MTT no revelaron ningún cambio significativo en la actividad mitocondrial. El ensayo de captación de rojo neural (NRU) mostró una pérdida de integridad lisosomal a contenidos de rGO ≥100 μg/mL (Figura 17a). La citometría de flujo indicó que la captación de yoduro de propidio (PI) aumenta notablemente en el nivel más alto de rGO (250 μg/mL), lo que demuestra una pérdida de integridad de la membrana (Figura 17b). Aparentemente, los rGOs sintetizados en verde son menos tóxicos si se comparan con los rGOs preparados a partir de una estrategia convencional que utiliza reactivos reductores tóxicos. [105]

Figur 17
Figura 17 (a) Captación de rojo neural y (b) resultados de citometría de flujo (estimación de PI) para el rGO sintetizado en verde expuesto a células de linfocitos humanos. Reproducido de [105] con permiso de Public Library of Science.

En un estudio reciente llevado a cabo por Mittal et al., se descubrió que el GO inducía toxicidad a niveles más altos que el rGO al ser expuesto a las células epiteliales alveolares humanas A549 y bronquiales (BEAS-2B). La presencia de grupos oxigenados en los GOs condujo al aumento de la citotoxicidad, debido a la formación de ROS y estrés oxidativo. Del mismo modo, Das et al. demostraron que el GO es más tóxico que el rGO del mismo tamaño al exponerlo a las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). El GO con abundantes grupos funcionales de oxígeno tiene un mayor potencial para interactuar con las células endoteliales, lo que provoca un alto nivel de ROS y daños en el ADN. El estrés oxidativo se manifiesta por una elevada expresión génica de la hemo oxigenasa 1 (HO1) y de la tiorredoxina reductasa citosólica (TrxR). [125,126]

Sasidharan et al. estudiaron el efecto del TRG y del TRG carboxilado (f-TRG) sobre la viabilidad de las células de riñón de mono Vero. La medición del ángulo de contacto reveló que las escamas de TRG eran hidrofóbicas con un gran ángulo de contacto con el agua de 162°, y las escamas de f-TRG eran hidrofílicas con un ángulo de 30° debido a la presencia de grupos carboxilo. Los copos de TRG hidrofóbicos se acumularon en la membrana plasmática, mientras que los copos de f-TRG fueron internalizados por las células, como revelaron las imágenes de microscopía confocal de fluorescencia. Por lo tanto, el TRG hidrofóbico puede inducir fuertes interacciones con los lípidos de la membrana que conducen a una toxicidad física directa, como la extracción de lípidos, como se mencionó anteriormente. [127]

La viabilidad de las células disminuyó notablemente con el aumento de las concentraciones de TRG. A 100 mg/mL, casi 50% células estaban muertas, y aumentaron a cerca de 60% a 300 mg/mL En cambio, las muestras de f-TRG mostraron efectos insignificantes sobre la viabilidad, incluso a una concentración alta de 300 mg/mL (Figura 18a). A pesar de que los copos de f-TRG fueron internalizados por las células, su actividad metabólica no se vio afectada. La Figura 18b muestra la fuga de LDH celular debido a las exposiciones a TRG y f-TRG. Como es sabido, las moléculas de LDH se liberan al medio desde las células con la membrana dañada. Por lo tanto, el nivel de LDH en el medio de cultivo es un indicador del daño de la membrana celular. A 300 mg/mL, los copos de TRG causaron la muerte completa de las células, pero no hubo fuga de LDH. No está claro cómo f-TRG podría tener un efecto beneficioso sobre la viabilidad celular, y sus grupos carboxilo no interactúan con las células Vero, como en el caso del GO (con grupos carboxilo) que muestra interacciones con las células pulmonares epiteliales humanas y HUVEC. Este efecto puede deberse a los diferentes tipos de células y a las características fisicoquímicas del GO y del f-TRG. La tabla 1 resume la toxicidad dependiente del tamaño, la dosis y el tiempo inducida por el grafeno y sus derivados al exponerlos a células de mamíferos.

Figur 18
Figura 18 (a) Viabilidad celular y (b) fuga de lactato deshidrogenasa (LDH) de células Vero tratadas con TRG y f-TRG a diferentes concentraciones. Reproducido de [127] con permiso de The Royal Society of Chemistry.
Tabelle 1 5

Tabelle 1 6

Tabelle 1 7

Modelo animal in vivo

En el sistema in vivo, se emplea el animal vivo completo para evaluar el efecto de la toxicidad inducida por los nanomateriales basados en el grafeno. Se puede obtener información útil sobre las interacciones entre las células y el grafeno mediante exámenes histológicos y microscópicos de los tejidos de los órganos pertinentes y de las células inflamatorias de los animales tras la alimentación oral, la administración intravenosa, la inyección intraperitoneal (i.p.), la instilación intratraqueal, la aspiración orofaríngea, la inyección subcutánea, etc. El efecto in vivo del GO y sus derivados depende en gran medida de la naturaleza química de los nanomateriales, del tiempo de exposición, de la dosis y de la vía de administración, así como del tipo de animales empleados para las pruebas. Según el primer estudio de Yang et al., el PEG-GO no indujo una toxicidad apreciable en los ratones tras su administración intravenosa con una dosis de 20 mg/kg durante tres meses, según la bioquímica sanguínea y los exámenes hematológicos e histológicos. [48]

El PEG-GO se acumuló principalmente en el hígado y el bazo, y se eliminó de estos órganos por excreción renal y fecal. En otro estudio, administraron 4 mg/kg de GO a ratones balb/c por vía i.p. y oral, tras lo cual realizaron exámenes histológicos y hematológicos. Según sus conclusiones, el GO permaneció en el cuerpo del ratón durante un largo período de tiempo tras la inyección i.p., y su toxicidad para los ratones fue insignificante. Ali-Boucetta et al. indicaron que el GO purificado no indujo la inflamación ni la formación de granulomas en los ratones tras la inyección i.p. Los estudios in vivo realizados por otros trabajadores también descubrieron que el GO no indujo cambios en el aspecto del globo ocular y la presión intraocular de los conejos, mientras que el amino-GO no indujo trombotoxicidad pulmonar en ratones tras la inyección intravenosa. [128-131]

Por el contrario, el LPE-grafeno prístino resultó ser tóxico y se distribuyó principalmente en el cerebro y el riñón de los embriones de pollo. El hallazgo no fue sorprendente porque el LPE-grafeno contenía residuos tóxicos de disolventes y surfactantes, como se ha mencionado anteriormente. Varios estudios in vivo en ratones revelaron que el GO induce una respuesta inflamatoria, un edema pulmonar y la formación de granulomas, especialmente a altas concentraciones. Además, se encontró una inflamación dependiente de la dosis, el tamaño y el tiempo en el pulmón y el hígado, con infiltración celular y fibrosis. Por ejemplo, Wang et al. informaron de que los GO con una dosis baja (0,1 mg) y una dosis media (0,25 mg) no presentaban una toxicidad evidente para los ratones Kunming (KM) tras su inyección intravenosa. Con una dosis alta de 0,4 mg por animal, se observó toxicidad crónica, como la muerte de los ratones y la formación de granulomas pulmonares. Las muertes se produjeron entre 1 y 7 días después de la inyección intravenosa. Además, los GOs se localizaron principalmente en el pulmón, el hígado y el bazo. Zhang et al. indicaron que el efecto in vivo de los GOs depende de la dosis. A una dosis de 1 mg/kg, se encontró una baja captación en el sistema reticuloepitelial (RES) y no se encontraron cambios patológicos en los ratones mediante inyección intravenosa durante 14 días. Sin embargo, se observó infiltración de células inflamatorias, edema pulmonar y formación de granulomas en el pulmón con una dosis de 10 mg/kg. Ma et al. administraron 5 mg/kg de peso corporal de GOs pequeños (50-350 nm) y GOs grandes (750-1300 nm) a ratones machos balb/c mediante instilación i.p. e intratraqueal durante tres días. [47,110,118,132-135]

Indicaron que el desencadenamiento de grandes GOs aumentó la expresión de citoquinas inflamatorias en la cavidad abdominal y la sangre de los ratones tras la inyección i.p. Esto condujo a un mayor reclutamiento de leucocitos en las cavidades peritoneales, dando lugar a una inflamación aguda. Tras la instilación intratraqueal, los GO de gran tamaño también provocaron un aumento drástico de la producción de citoquinas inflamatorias pulmonares y sistémicas, así como del reclutamiento de células inflamatorias. Más recientemente, Amrollahi-Sharifabadi et al. inyectaron por vía intraperitoneal GOs (5-10 μm) con dosis de 50, 150 o 500 mg/kg en ratas Wistar. Los GOs entraron primero en la sangre y luego se localizaron en el hígado. Como se sabe, la bilirrubina es una enzima hepática que puede servir como biomarcador del daño hepático. A partir del análisis hematológico, los GOs con una dosis de 500 mg/kg produjeron un aumento significativo en el nivel sérico de bilirrubina después de 21 días, lo que implica toxicidad hepática. Además, los GOs indujeron una inflamación y una reacción granulomatosa de forma dependiente de la dosis. Xia y colaboradores realizaron una aspiración orofaríngea de GO, hGO y rGO en ratones C57BL/6. Informaron de que el GO hidratado es más tóxico que el GO y el rGO. El hGO indujo una inflamación pulmonar aguda, acompañada de la mayor peroxidación lipídica en los macrófagos alveolares y de la producción de citoquinas debido a la formación de radicales de carbono. [87,135]

En el cultivo de células in vitro, el GO-PEG indujo respuestas inmunitarias a través de la secreción de citoquinas en macrófagos murinos. Por lo tanto, la PEGilación no ayudó a pasivar las superficies de GO. Es interesante saber si las láminas de GO-PEG inducen un efecto tóxico en modelos animales in vivo. Recientemente, Xu et al. administraron a ratones balb/c GO, GO-PEG, GO-PAA, GO-NH2 y GO-PAM a 0,05, 1, 5, 10 y 20 mg/kg de peso corporal mediante una inyección intravenosa. La tasa de supervivencia de los ratones fue de 100%, 80%, 60%, 20% y 0%, respectivamente, con las dosis de GO prescritas. Los ratones administrados con GO a 1 mg/kg durante 1 día y 14 días sufrieron una importante disminución de plaquetas en la sangre periférica. El GO-PAM y el GO-PEG también causaron depleción de plaquetas durante un día, pero no se encontró depleción en el GO-NH2 y el GO-PAA. Los GOs se acumularon principalmente en el pulmón, el bazo y el hígado, como indica el análisis de espectrometría de masas por desorción/ionización láser (LDIMS) (Figura 19a). [117,118,119]

La característica de los pulmones se oscureció con el aumento de las dosis de GO, lo que implica una mayor aglomeración y acumulación de GO (Figura 19b). Las observaciones histológicas de los órganos pulmonares y del bazo se llevaron a cabo mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y tricrómica de Masson (Figura 19c,d). En la tinción de H&E, los núcleos de las células se tiñeron de azul con hematoxilina, mientras que el citoplasma y la matriz extracelular se tiñeron de rosa con eosina. El GO y el GO-PAM indujeron graves lesiones pulmonares, como lo demuestra el engrosamiento de la pared alveolar debido a la infiltración de células inflamatorias y el aumento del colágeno en los bronquiolos. Sin embargo, el GO-PAA causó menos daños en el pulmón y el hígado en comparación con otros ratones tratados con GO, GO-NH2, GO-PAM y GO-PEG. Xu et al. atribuyeron estas diferencias a los distintos cambios en el contenido de IL-6 y colágeno 1 debido a la fibrosis (figura 19e,f) y a las composiciones de las coronas proteicas. GO-PAA y GO-PEG contenían un menor contenido de inmunoglobulina G en sus coronas proteicas (30-40%) que GO, GO-NH2 y GO-PAM (50-70%). De ellos, GO-PEG es moderadamente más seguro que GO in vivo, GO-PAA muestra la mejor compatibilidad, y GO-PAM exhibe la mayor citotoxicidad in vitro e in vivo.

Figur 19
Figura 19 (a) Análisis de imágenes de espectrometría de masas por desorción/ionización láser (LDIMS) que muestra la biodistribución del GO en ratones tratados con GO (2 mg/kg de peso corporal) durante un día. (b) Imágenes de los pulmones de los ratones después del tratamiento con GO a 0,05, 0,25, 0,5, 1 y 2 mg/kg de peso corporal durante un día. Imágenes histológicas de (c) pulmones teñidos con H&E y tricrómico de Masson y (d) hígados con H&E de ratones inyectados con 1 mg/kg de GO durante 14 días. Las imágenes ampliadas de los cuadrados de las líneas son los alvéolos pulmonares agrandados. Las manchas oscuras son los complejos celulares de GO en los hígados. En la tinción con tricrómico de Masson, el color azul revela el colágeno en el pulmón. (e) Niveles de IL-6 en sueros de ratones tratados con una dosis de 1 mg/kg de peso corporal durante 1 día (n = 5). (f) Marcadores proteicos de colágeno 1, Gr1, CD68 y CD11b medidos mediante análisis de Western blot en pulmones de ratones tratados con 1 mg/kg de peso corporal durante 14 días. Los datos cuantificados se muestran en el panel derecho (n = 4). * y ** implican p < 0,05 y p < 0,005 en comparación con los ratones tratados con PBS. Reproducido de [119] con permiso de The American Chemical Society.

Syama et al. administraron PrGO (rGO-PEG) con una dosis de 10 mg/kg de peso corporal a ratones suizos albinos mediante inyecciones intraperitoneales e intravenosas durante 3, 7, 14 y 21 días. Se utilizó la microscopía confocal Raman para analizar la biodistribución del PrGO. Las imágenes Raman de la sangre, la orina, la médula ósea y otros órganos al final de los períodos prescritos mostraron la presencia de láminas de PrGO en el cerebro, el hígado, el riñón, el bazo y la médula ósea. Los análisis de orina revelaron una intensidad de PrGO muy débil, lo que demuestra una baja tasa de excreción renal de PrGO a través del riñón. La captación de PrGO en el cerebro por ambas vías de inyección reveló que la PrGO puede atravesar la barrera hematoencefálica (BBB) y luego acumularse en el cerebro. Recientemente, Shang et al. administraron 4 mg/kg de PrGO en ratones balb/c a través de i.p. inyección. Los altos niveles de ROS y MDA debidos a la peroxidación lipídica fueron los responsables de los daños cerebrales y renales. Syama et al. también demostraron que las vías de inyección también afectan a la translocación de la PrGO en los órganos de los ratones. La PrGO inyectada por vía intravenosa se translocó desde el sistema circulatorio sanguíneo hasta el hígado y el bazo después de tres días. La máxima captación de PrGO se encontró en el hígado y el bazo, seguidos del riñón y el cerebro. En el caso de i.p. La PrGO se adsorbió primero en la cavidad peritoneal y luego se acumuló en el hígado. La inyección repetida de PrGO causó una lesión hepática aguda y aumentó la proliferación de esplenocitos. [23,136]

La proliferación de esplenocitos estimuló las respuestas del sistema inmunitario debido a la presencia de una variedad de tipos celulares con diferentes funciones inmunitarias, como macrófagos, células dendríticas, células B y células T dentro del bazo. Del mismo modo, Mendonca et al. informaron de que el rGO y el rGO-PEG debilitan la unión de la BBB de los ratones Wistar como resultado de la generación de ROS y de peroxidación lipídica. Los aumentos en los niveles de enzimas antioxidantes de catalasa, SOD-1 y sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico en el hipocampo fueron responsables de la generación de estrés oxidativo. Estos resultados indicaron que la funcionalización de la superficie de los GOs y rGOs con PEG no puede eliminar completamente la citotoxicidad que es inducida por el grafeno. Se necesitan más estudios sistemáticos de toxicidad frente a cuestiones de biocompatibilidad, especialmente en modelos animales, para comprender los efectos biológicos y la seguridad de los nanomateriales de grafeno para los seres humanos. [117,137,138]

A partir de los estudios in vivo en animales, las ERO y el estrés oxidativo parecen ser los factores clave que causan daños en la membrana celular tras la exposición a los GO. Como es sabido, los niveles elevados de ROS pueden alterar los lípidos, las proteínas y el ADN, lo que provoca el daño de la membrana y la eventual muerte celular. Por lo tanto, el estrés oxidativo está vinculado a una amplia gama de anomalías patológicas y enfermedades degenerativas, especialmente en los eritrocitos y las células cerebrales que implican el transporte de oxígeno y la respiración aeróbica. La tabla 2 presenta una lista de estudios in vivo que resumen las diferentes vías de administración de los nanomateriales basados en el GO y sus efectos biológicos asociados. [23,136,137,139-145]

Tabelle 1 8

Tabelle 1 9

Tabelle 1 10

Nanocompuestos de GO-Polímero

Los GO pueden dispersarse bien en el agua debido a la presencia de grupos oxigenados. Así, los polímeros hidrolíticos, como el alcohol polivinílico (PVA) y el PEG, pueden reaccionar fácilmente con el GO en solución acuosa para formar nanocompuestos poliméricos. El enlace de hidrógeno entre los grupos oxigenados del GO y el PVA puede evitar la agregación del relleno y promover las interacciones polímero-relleno. En comparación con el polímero prístino, la resistencia mecánica de los nanocompuestos de GO/PVA aumenta notablemente debido al eficaz mecanismo de transferencia de tensiones de la matriz polimérica a los rellenos de GO durante los ensayos de tracción. Los polímeros sintéticos biodegradables, como el ácido poliláctico (PLA), el poliglicólido (PGA) y el copolímero de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), encuentran aplicaciones útiles en el campo biomédico, incluyendo la administración de fármacos y la ingeniería de tejidos óseos como suturas y andamios. El PLA es un polímero hidrofóbico debido a la presencia de grupos laterales -CH3 en sus unidades repetidas. Los grupos de metileno hacen que el PLA tenga una tasa de biodegradación lenta, baja resistencia mecánica y dureza. La escasa resistencia mecánica del PLA dificulta su desarrollo para la fabricación de dispositivos de fijación interna para huesos fracturados en ortopedia. [77,146,147,148]

Los dispositivos de fijación de polímero biodegradable tienen una clara ventaja sobre sus homólogos metálicos, ya que los dispositivos pueden degradarse en el cuerpo humano, por lo que la cirugía de revisión para retirarlos es innecesaria. Esto reduce en gran medida el dolor de los pacientes que sufren fracturas óseas y el coste de la atención hospitalaria. En los últimos años, el número de pacientes que padecen enfermedades relacionadas con los huesos, como el cáncer y las fracturas óseas, aumenta considerablemente debido al incremento de la población de edad avanzada y a la contaminación ambiental en todo el mundo. Además, las actividades deportivas y recreativas también provocan lesiones óseas en los adultos. En el sector biomédico existe una necesidad urgente de desarrollar biomateriales avanzados y nanocompuestos poliméricos con buena biocompatibilidad para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos. En los últimos años, la atención se ha centrado en la mejora de la biocompatibilidad y las propiedades mecánicas de los poliésteres biodegradables reforzados con GOs. El rendimiento mecánico del PLA puede mejorarse añadiendo bajos contenidos de GO. Esto se debe a que el GO, con un módulo elástico más alto (207,6 ± 23,4 GPa), es un refuerzo eficaz para que el PLA forme nanocompuestos poliméricos. Además, el GO también promueve la adhesión y la proliferación de las células óseas (osteoblastos), así como la diferenciación de las células madre. En este sentido, los biocompuestos de GO/PLA con buena biocompatibilidad y resistencia a la tracción son biomateriales ideales para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos y medicina regenerativa. [80,149-152]

Arriagada et al. estudiaron los efectos de las adiciones de GO (0,5-5 wt.%) y TRG (1-10 wt.%) sobre la biocompatibilidad de los nanocompuestos GO/PLA y PLA/TRG mezclados en fusión. La línea celular de osteosarcoma humano (Saos-2) se cultivó en estos nanocompuestos. Cuando se compara con el PLA prístino, la adición de sólo 0,5 wt.% de GO al PLA mejora la viabilidad de Saos-2 de menos de 70% a cerca de 90% (Figura 20). La viabilidad de las células puede mejorarse aún más añadiendo 1 peso de GO. Esto se debe a que el GO hidrofílico puede mejorar la adsorción de proteínas y la posterior adhesión celular. En el caso de los nanocompuestos PLA/TRG, la viabilidad de Saos-2 sigue siendo casi la misma que la del PLA puro, a excepción del nanocompuesto PLA/1% TRG. El TRG hidrofóbico no mejora la adhesión y la proliferación de Saos-2. [81]

En cuanto a las propiedades mecánicas, el módulo elástico del PLA aumenta de aproximadamente 2,1 GPa a 2,2 GPa y 2,4 GPa, respectivamente, al añadir 1 wt.% y 2 wt.% de GO, lo que corresponde a una mejora de la rigidez de 4,8% y 14,3%. Del mismo modo, Pinto et al. también encontraron que el GO mejora la adhesión y la proliferación de fibroblastos en las superficies de las películas de nanocompuestos de PLA/GO. Cabe destacar que las suspensiones de GO con bordes afilados pueden penetrar en la membrana celular y alcanzar el citoplasma, lo que conduce a un mayor nivel de ROS y a la eventual muerte de la célula, como se ha mencionado anteriormente. Sin embargo, la matriz polimérica de los nanocompuestos de polímero puede sellar eficazmente los bordes afilados de los GO, evitando así el daño de la membrana celular por la penetración de los GO. Dado que los GOs están firmemente unidos a la matriz polimérica, no pueden moverse libremente para inducir el daño de la membrana celular y la apoptosis. En este sentido, los GOs con grandes áreas de superficie proporcionan sitios eficaces para la adhesión y la proliferación de los osteoblastos durante el cultivo celular. [15,153]

Figur 20
Figura 20 Resultados de MTT para nanocompuestos de PLA/GO y óxido de grafeno/ácido poliláctico reducido térmicamente (PLA/TRG) cultivados con Saos-2. * denota significación estadística entre los grupos experimentales y el control. + representa la significación estadística entre los grupos experimentales y el PLA (n = 6; p < 0,05). Reproducido de [81] con permiso de Wiley.

Los hidrogeles convencionales que se sintetizan a partir del uso de reticulantes orgánicos presentan muchos inconvenientes, como la escasa absorción y las propiedades mecánicas y estructurales. Los hidrogeles son redes tridimensionales hidrofílicas de polímeros capaces de absorber una gran cantidad de agua o fluidos biológicos, por lo que presentan atractivas aplicaciones en ingeniería de tejidos y administración de fármacos. Se sabe que el GO es un refuerzo eficaz para los sistemas de hidrogeles debido a sus abundantes grupos hidrofílicos en la superficie. Así, el GO puede establecer fuertes interacciones interfaciales con polímeros solubles en agua (por ejemplo, PVA, PEG y PAA) mediante enlaces químicos o de hidrógeno. [154-162]

Por ejemplo, Zhang et al. prepararon un hidrogel compuesto de GO/PVA con una resistencia a la tracción mejorada de 3,48 MPa mediante la adición de 0,8 wt% de GO, lo que supone un aumento de 132% respecto al hidrogel de PVA puro. Dicho hidrogel nanocompuesto tenía un efecto no tóxico sobre los osteoblastos. La introducción de PEG podría conducir a un injerto más eficiente de las moléculas de PVA en la superficie del GO. Así, el GO se exfolió y se dispersó uniformemente en la matriz de PVA de los hidrogeles GO/PVA-PEG. Zhong et al. prepararon hidrogeles nanocompuestos de GO/PAA con una elongación a la rotura de 2980% y una resistencia a la tracción de 777 kPa, cuya red reticulada fue facilitada por la reticulación física de iones (iones Fe3+). Muy recientemente, Jing et al. prepararon hidrogeles rGO/PAA autocurables que presentaban una buena biocompatibilidad con los fibroblastos y una elevada capacidad de estiramiento, mostrando así una potencial aplicación para dispositivos de piel artificial. [157,159,161,162]

Conclusiones

En esta revisión, resumimos y discutimos los procesos de síntesis de los nanomateriales basados en grafeno, su biocompatibilidad y su citotoxicidad. Además, también se abordó la citotoxicidad in vitro e in vivo de los nanomateriales basados en grafeno. El principal reto de la comercialización del grafeno en la actualidad es producir grafeno de alta calidad a gran escala y a bajo coste. La calidad del grafeno desempeña un papel importante en el campo biomédico, ya que la presencia de impurezas puede tener un efecto adverso en las células de mamíferos al inducir daños en la membrana celular y apoptosis. La comprensión adecuada de las interacciones directas entre el grafeno nanoestructurado y las células de mamíferos puede obtenerse utilizando grafeno puro. Aunque la exfoliación mecánica de las escamas de grafito puede producir grafeno puro, el rendimiento es muy bajo para fines de manipulación celular. El grafeno por CVD es demasiado caro y su proceso de transferencia desde la lámina de cobre o níquel al sustrato de vidrio o SiO2/Si objetivo es tedioso.

Sin embargo, el CVD-grafeno de alta calidad proporciona información útil relacionada con sus interacciones con las células. La mayoría de los estudios de cultivo celular in vitro revelaron que el CVD-grafeno con una dimensión a nanoescala es biocompatible con varias líneas celulares, especialmente mejorando la adhesión de los fibroblastos y promoviendo la diferenciación de las hMSC en células óseas. Estos resultados son alentadores para las posibles aplicaciones del grafeno en ortopedia. La preparación de las láminas de grafeno LPE requiere disolventes y tensioactivos tóxicos para la exfoliación del grafeno. Estos reactivos químicos, especialmente los surfactantes, son difíciles de eliminar de las láminas de grafeno finales, por lo que el uso del grafeno LPE en el campo biomédico es limitado. Un ejemplo típico es que el LPE-grafeno induce citotoxicidad en los tejidos del cerebro y del riñón de embriones de pollo. [132]

Hasta ahora, los GOs preparados por el proceso Hummers modificado se utilizan ampliamente para investigar sus interacciones y respuestas con las células de mamíferos in vitro e in vivo. En la literatura se encuentran resultados contradictorios sobre la biocompatibilidad y la citotoxicidad de los GOs y los rGOs en condiciones in vitro e in vivo. Esto se debe, en parte, a que los investigadores emplean distintos tiempos de oxidación, distintos tipos y distintas concentraciones de oxidantes para la síntesis, lo que produce GOs con una estructura y reactividad, así como un nivel de impurezas, que difieren de un estudio a otro. La diversidad en las propiedades estructurales tiene un gran impacto en las interacciones célula-GO. Además, los distintos oxidantes y reductores químicos utilizados para preparar GOs y rGOS pueden generar impurezas metálicas y contaminaciones orgánicas, alterando así sus interacciones con las células, los tejidos y los órganos, y provocando daños celulares y apoptosis.

En particular, el agente reductor tóxico de la hidracina provoca importantes destrucciones celulares en las hMSC a muy bajo contenido de rGO (1,0 μg/mL), mientras que el Na2S residual en el rGO induce graves respuestas proinflamatorias en los macrófagos. Estos efectos adversos pueden explicar en parte las discrepancias en los resultados experimentales reportados en la literatura. Los GOs y rGOs que se prepararon a partir de la ruta de síntesis verde son nanomateriales bastante prometedores para aplicaciones biomédicas, ya que pueden reducir la citotoxicidad en un grado bajo. [105,122,133]

Se considera que la toxicidad de los GOs/rGOs puede minimizarse dispersándolos en polímeros para formar nanocompuestos poliméricos. De este modo, los nanomateriales de grafeno quedan inmovilizados al estar firmemente unidos a la matriz polimérica de los nanocompuestos. Además, la matriz polimérica puede sellar los bordes afilados de los GOs/rGOs, impidiendo su penetración en el citoplasma. Así pues, los nanorellenos de grafeno con grandes áreas de superficie proporcionan lugares eficaces para la adhesión y la proliferación celular, especialmente para los osteoblastos (células óseas). Además, los grupos oxigenados de los GOs pueden reducir la hidrofobicidad de la matriz polimérica, facilitando así la adhesión y propagación de las células en la superficie del polímero. Este enfoque abre nuevas oportunidades para las aplicaciones biomédicas de los nanomateriales de grafeno en ortopedia para fabricar dispositivos avanzados de fijación ósea, andamios e implantes. Hay que seguir evaluando e investigando la seguridad para garantizar que estos nanocompuestos poliméricos sean biocompatibles con los tejidos humanos antes de su aplicación clínica. [15,16]

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