¿Qué toxicidad tienen las nanopartículas de óxido de grafeno?


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Los nanomateriales de ingeniería basados en el carbono, como las nanopartículas de óxido de grafeno (GO NPs), están ampliamente disponibles para su aplicación, pero sus efectos potencialmente adversos para la salud de los seres humanos todavía requieren investigación.

Investigación con nematodo y óxido de grafeno

En este estudio, se abordan los niveles ambientales de las NPs de GO para examinar si el GO produce efectos adversos en un modelo in vivo de Caenorhabditis elegans (C. elegans). Se utilizaron nematodos con una exposición prolongada (de larvas L1 a adultos jóvenes) a las NPs de GO a 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 mg L-1 para evaluar los posibles efectos tóxicos, incluyendo la letalidad (toxicidad aguda), las respuestas reproductivas (tamaño de la cría) y neurológicas (locomoción, incluyendo la sacudida de la cabeza y la flexión del cuerpo), la longevidad (tiempo de vida) y el estrés oxidativo (expresión génica de sod-1, sod-3 y clt-2).

La exposición prolongada a las NPs de GO no indujo letalidad en los niveles selectivos. En las pruebas de tamaño de la cría y de choque de la cabeza, las respuestas biológicas de los nematodos se redujeron significativamente con la exposición a 0,0100-1,00 ng L-1 de GO NP en comparación con el control no tratado. Los nematodos expuestos a NP GO a 0,00100-1,00 ng L-1 mostraron retrasos significativos en el comportamiento de flexión del cuerpo en comparación con el control. En el examen de la longevidad de los nematodos, se descubrió que la vida útil de todos los gusanos expuestos a las NP de GO se redujo significativamente en comparación con los gusanos no tratados. La expresión génica de sod-1, sod-3 y ctl-2 presentó pliegues de inducción significativamente mayores en los gusanos expuestos en comparación con los controles. En consecuencia, la exposición prolongada a las dosis bajas de NPs de GO podría estar asociada con la interrupción de la reproducción y la locomoción, la atenuación de la longevidad y la inducción del estrés oxidativo en los nematodos.

Introducción

Las nanopartículas de óxido de grafeno (GO NPs), uno de los derivados más prometedores del grafeno, comprenden un nanomaterial de ingeniería (ENM) monocapa con un alto contenido de grupos funcionales que contienen oxígeno, como carboxilo, epoxi, carbonilo e hidroxilo (Bianco et al., 2013; Li et al., 2015). Se sabe que el óxido de grafeno (GO) tiene una excelente dispersabilidad en muchos disolventes, reactividad química y capacidad de funcionalización química (Konios et al., 2014; De Marchi et al., 2018). La capacidad de adsorción de las NPs de GO se ha aprovechado para aplicaciones de remediación ambiental, como en las membranas basadas en GO, que eliminan contaminantes gaseosos como el dióxido de azufre y el sulfuro de hidrógeno (Fakhri, 2017). Además, también actúan como adsorbentes para la eliminación de diversos contaminantes acuosos debido a su alto contenido de grupos de oxígeno funcionalizados disponibles para interactuar con iones metálicos (Li et al., 2019).

Además, las nanopartículas de GO pueden aplicarse a la nanoelectrónica, la catálisis, los nanocompuestos, la tecnología de sensores, la purificación y desalinización del agua y la administración de fármacos (Zhang et al., 2011; Pan et al., 2012; Giust et al., 2018; Prasad et al., 2020). Según los estudios de Yang et al. (2015) y Maharubin et al. (2016), el GO puede utilizarse para el almacenamiento de hidrógeno (ánodo, cátodo y baterías de litio-azufre) y la gestión de supercondensadores. Además, los compuestos de GO se utilizan como agentes antimicrobianos para la desinfección del agua con el fin de eliminar las moléculas orgánicas y los patógenos transmitidos por el agua (Upadhyay et al., 2014). Varios estudios utilizaron los niveles ambientales a µg L-1 a mg L-1 de contaminación por GO NP para probar los modelos in vivo (He et al., 2017; Zhang et al., 2017; Li et al., 2019).

El mercado mundial de productos basados en el grafeno, como el GO, está aumentando. Se espera que la demanda sea de $675 y 987 millones para 2020 y 2022, respectivamente (Ahmed y Rodrigues, 2013). Debido a su potencial tanto de producción como de aplicación, se espera que los materiales de GO se liberen en el medio ambiente durante su ciclo de vida y que finalmente se generen en vertederos y plantas de tratamiento de aguas residuales (Du et al., 2017; Suárez-Iglesias et al., 2017; Jamialahmadi et al., 2018). El GO puede ser liberado en el medio ambiente acuático a través del desarrollo de sus compuestos como adsorbentes para la contaminación acuosa, membranas para la filtración y purificación del agua y catalizadores para la descontaminación ambiental (Zhao et al., 2014; Goodwin et al., 2018).

Varios estudios han informado de que la dispersión y el largo tiempo de retención del GO en las comunidades microbianas pueden provocar graves efectos negativos en la flora microbiana de las aguas residuales debido a su hidrofilidad (Lyon y Álvarez, 2008; Kang et al., 2009; Rodrigues y Elimelech, 2010). Las concentraciones ambientales previstas de GO pueden correlacionarse con las de los nanotubos de carbono de pared múltiple porque ambos tienen propiedades relativamente similares, como el tamaño nanométrico, una estructura basada en el carbono y aplicaciones en dispositivos electrónicos de consumo (Zhang et al., 2017).

Pocos estudios epidemiológicos se han centrado en la exposición humana al GO, en particular para la población altamente expuesta. Para los modelos in vivo, incluyendo ratas, ratones, peces cebra, nematodos y dafnias, los animales podrían inducir nanotoxicidad, incluyendo toxicidad aguda, de desarrollo, neurológica, reproductiva, inmunológica y neuroconductual, así como una longevidad acortada después de haber sido expuestos a NPs de GO (Sánchez et al., 2012; Patlolla et al., 2017; Qu et al., 2017; Souza et al., 2017; Kim et al., 2018; Qu et al., 2019; Kim et al., 2020). En los últimos años, se han investigado los efectos tóxicos in vivo e in vitro de las NPs de GO, incluyendo la inmunotoxicidad, la activación de la inflamación, la inducción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la generación de estrés oxidativo, la apoptosis y los posibles mecanismos de exposición de GO (Guo y Mei, 2014; Bengtson et al., 2017; Pelin et al., 2018; Tang et al., 2018).

La acumulación de GO en el citoplasma provoca dramáticas alteraciones morfológicas y reduce la capacidad del receptor toll-like 4 (TLR4) para la fagocitosis (Qu et al., 2013a). Sin embargo, un aumento de las ERO intracelulares contribuye a la muerte celular necrótica en los macrófagos (Qu et al., 2013a). Estudios anteriores también han informado de que el GO promueve la inhibición del crecimiento celular, el retraso de la eclosión, la generación de ROS y daña el sistema circulatorio de los embriones de pez cebra (Liu et al., 2014; Chen et al., 2016; Souza et al., 2017). En ratones, el GO puede acumularse en órganos como el hígado, los pulmones, el bazo y los riñones, lo que puede inducir toxicidad en el organismo a través del estrés oxidativo intracelular causado por la acumulación de ROS (Qu et al., 2013b; Yang et al., 2013). El GO puede entrar en el cuerpo humano a través de la inhalación y puede depositarse en regiones del tracto respiratorio. Cuando se deposita en las regiones alveolares, puede dificultar el aclaramiento, formar granulomas y posiblemente producir fibrosis (Sánchez et al., 2012).

El modelo in vivo utilizado en este estudio fue el nematodo transparente Caenorhabditis elegans (C. elegans), que se ha utilizado con éxito en la evaluación toxicológica de varios nanomateriales como las NPs de GO (Zhang et al., 2012; Wu et al., 2013; Piechulek y von Mikecz, 2018). Las ventajas de C. elegans como sistema modelo in vivo fueron las siguientes: (1) anatomía simple, (2) transparente, (3) linaje celular invariable, (4) ciclo de vida corto con gran tamaño de cría, (5) embriones fácilmente accesibles, (6) mantenimiento fácil y barato en el laboratorio, y (7) potente herramienta experimental (Brenner, 1974; Hunt, 2017). El modelo de C. elegans no es un modelo de mamífero que no esté disponible para examinar varios puntos finales tóxicos como el azúcar y la presión sanguínea, los tejidos en la piel, el sistema probiótico en el intestino, el corazón y las enfermedades cardiovasculares. Se considera que C. elegans es una herramienta novedosa para las técnicas in vivo, y se sabe que las pruebas de C. elegans son análogas a las pruebas de neurotoxinas en mamíferos (Cole et al., 2004).

Recientemente, los científicos se han centrado en la alteración de los efectos biológicos de las ROS, los efectos reproductivos, la expresión génica, el desarrollo neurológico y el neurocomportamiento con el tratamiento de las NPs de GO en modelos de C. elegans (Wu et al., 2013; Qu et al., 2017; Kim et al., 2018; Rive et al., 2019; Kim et al., 2020; Zhao et al., 2020). Zhang et al. (2012) no indicaron ningún impacto negativo en la longevidad tras exponer a C. elegans de larva a joven adulto a NPs de GO en concentraciones que iban de 5 a 20 mg L-1. Por el contrario, los C. elegans con una exposición prolongada (desde la larva L1 hasta el adulto joven) a 0,5-100 mg L-1 de NPs de GO presentaron efectos adversos en los órganos diana primarios (órganos digestivos como el intestino) y secundarios (tejidos neurológicos como las neuronas y los órganos reproductores) (Wu et al., 2013).

Las NPs GO posiblemente acortaron la vida útil al influir en la expresión de la cascada de señalización DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 en el intestino de los nematodos (Zhao et al., 2016b). Tras la exposición a las GO NP, la expresión de sustancias neuronales puede disminuir la generación de ROS y reducir el comportamiento de locomoción en los nematodos (Zhao et al., 2020). Las NPs de GO probablemente causaron daños en las neuronas dopaminérgicas y glutamatérgicas en C. elegans después de la exposición crónica a las NPs de GO durante 6 días, desde la larva L1 hasta la etapa adulta (Li et al., 2017). Liu et al. (2020) observaron que las NPs de GO inducían la disfunción de la barrera intestinal en C. elegans. Rive et al. (2019) propusieron que los gusanos expuestos crónicamente (o de forma prolongada) a las NPs de GO (niveles de 100 y 200 mg L-1) tenían un tamaño significativamente reducido y desarrollaban anormalidades morfológicas en la faringe y el intestino.

Kim et al. (2018) descubrieron la acumulación de NPs de GO en los órganos reproductivos de C. elegans mediante espectrometría Raman. Además, la exposición a GO NP promovió la toxicidad reproductiva al suprimir la espermatogénesis de C. elegans durante el desarrollo, lo que resultó en una disminución del número de espermatozoides y de la progenie (Kim et al., 2018). Este estudio tenía como objetivo evaluar el efecto de las concentraciones ambientalmente relevantes de GO NPs en C. elegans mediante la evaluación de los puntos finales toxicológicos, incluyendo la letalidad aguda, la reproducción, la locomoción, la vida útil y la expresión génica.

Métodos

Preparación de nanopartículas de óxido de grafeno

Las NPs de GO se prepararon a partir de grafito expandible utilizando un método de Hummers modificado (Yan et al., 2014). En resumen, se vertió 1 g de potencia de grafito y 50 mL de ácido sulfúrico (H2SO4, 98%) en un matraz de 250 mL, seguido de la adición de 0,5 g de NaNO3. La mezcla se agitó mecánicamente durante 30 minutos en un baño de hielo. Para una mayor oxidación, se añadieron 5 g de permanganato de potasio (KMnO4) mientras se agitaba lentamente la mezcla durante 4 h. Posteriormente, se añadió H2O2 al MnO2 hasta que la mezcla se volvió amarilla. A continuación, se añadió HCl 1%, y la mezcla se centrifugó a 8000 rpm durante 5 minutos, seguido de 3 lavados con agua destilada para diluir la solución ácida.

Reactivos, productos químicos y cultivo de nematodos

Las NPs de GO se sometieron a sonicación durante 30 min (40 kHz y 100 W) para dispersarlas en medio K (50 mM, 30 mM KCl, 1,0 mg mL-1 y PH de 6,0) como solución madre (200 mg L-1) siguiendo los métodos de estudios anteriores (Wu et al., 2013; Zhao et al., 2016b). La solución madre se diluyó a varias concentraciones utilizando medio K antes de la exposición.

La cepa de C. elegans de tipo salvaje N2 fue donada por el Dr. Chang-Shi Chen del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Cheng Kung (Tainan, Taiwán). C. elegans se mantuvo en medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembrado con cultivos de Escherichia coli (E. coli) OP50 del Centro de Investigación y Colección de Recursos Biológicos (Hsinchu, Taiwán), y el caldo Luria-Bertani se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Las placas NGM contenían agar bacteriológico y bactopeptona, que se obtuvieron de Laboratorios Conda (S.A., España). El NaCl se obtuvo de Honeywell Fluka™ (Nueva Jersey, EE.UU.). Los gusanos sincronizados por edad se recogieron utilizando una mezcla de blanqueo que contenía NaOCl obtenido de J.T. Baker (Central Valley, PA) y KOH obtenido de Duksan Pure Chemicals (Gyeonggi-do, Corea del Sur).

Los reactivos suplementarios como CaCl2, K2HPO4 y colesterol se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.); el MgSO4 se adquirió de Avantor Performance Materials, ltd. (Gyeonggi-do, Corea del Sur); el KH2PO4 utilizado para el tampón de fosfato se adquirió de Avantor Performance Materials, LLC (Radnor, PA, EE.UU.), y el Na2HPO4 utilizado para el tampón M9 se obtuvo de Honeywell Fluka™ (Nueva Jersey, EE.UU.). Todas las observaciones fisiológicas se realizaron con un microscopio de disección (Olympus, SZX10, Waltham MA, EE.UU.). Los protocolos experimentales en el modelo de nematodo siguieron los utilizados en nuestro estudio anterior (Chung et al., 2019, 2020). Los exámenes de letalidad, crecimiento, reproducción y comportamiento de locomoción siguieron los protocolos publicados anteriormente, con pequeñas modificaciones (Chung et al., 2019, 2020).

Ensayo de letalidad y vida útil

Los nematodos fueron expuestos a NPs de GO (control, 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 µg L-1) durante 48 h (exposición prolongada) desde larvas L1 hasta adultos jóvenes incubados a 20°C. La exposición prolongada se realizó en una placa fresca con un césped de E. coli OP50. Tras el tratamiento, se evaluó la toxicidad letal de las muestras pinchándolas suavemente con un recogedor de gusanos. Los gusanos que no respondieron se consideraron muertos. Se realizaron tres réplicas biológicas y se ensayaron un total de 150 gusanos.

Los gusanos evaluados para el ensayo de vida útil se expusieron durante un período prolongado a las diferentes concentraciones de GO NP (el control sin tratar, 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 µg L-1) desde L1 hasta la fase de madurez para el ensayo de vida útil. Se transfirieron 50 gusanos a placas frescas cada dos días durante 4-5 días de puesta de huevos. Los nematodos vivos y muertos se evaluaron diariamente pinchándolos suavemente con un recogedor de gusanos. Se realizaron tres réplicas biológicas y se evaluaron un total de 150 gusanos. Se evaluaron varios indicadores de vida útil (vida media, día de la muerte del percentil 50, día de la muerte del percentil 75, día de la muerte del percentil 95 y día de todas las muertes) siguiendo el estudio de Chung (Chung et al., 2020).

Ensayo de reproducción y ensayo de locomoción

Se evaluó el tamaño de la cría (ensayo reproductivo) de los nematodos L3 o jóvenes L4 durante 4-5 días tras una exposición prolongada a diferentes concentraciones de GO NP (control, 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 µg L-1) a 20°C. Cada gusano se transfirió a una placa nueva y se volvió a transferir hasta que cesó el periodo de puesta de huevos. Las placas con huevos se incubaron hasta que la progenie pudo contarse fácilmente. Se evaluó un total de 30 gusanos para el ensayo de reproducción.

El comportamiento de locomoción, incluyendo el golpeo de la cabeza y la flexión del cuerpo en los modelos de nematodos, se expresó como la función de la neurona motora (Qu et al., 2019; Zhao et al., 2020). La flexión del cuerpo y el golpeteo de la cabeza de los nematodos (ensayo de locomoción) se evaluaron tras una exposición prolongada a varias concentraciones de GO NP (control, 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 µg L-1). La flexión del cuerpo se evaluó transfiriendo el gusano expuesto a una placa nueva. Después de un día, se contó la flexión del cuerpo de los gusanos durante 20 segundos. El golpeo de la cabeza se evaluó colocando el gusano expuesto en un portaobjetos de vidrio que contenía una cantidad adecuada de K-media. Se contó el movimiento de la cabeza de los gusanos durante 1 minuto. Se realizaron tres réplicas biológicas, en las que se evaluaron 60 gusanos para la flexión del cuerpo y 30 gusanos para el golpeo de la cabeza.

Pruebas de expresión genética

Los C. elegans de los distintos grupos de tratamiento (control sin tratar, 0,00100, 0,100 y 1,00 µg L-1) se recogieron en tres réplicas para la extracción de ARN tras la exposición. Se utilizó el reactivo Trizol (TIANGEN, China) para extraer el ARN total de acuerdo con el protocolo estándar del fabricante. Las concentraciones de ARN se midieron por la absorbancia a 260 nm, y la pureza del ARN se evaluó en base a la relación de las densidades ópticas de las muestras de ARN medidas a 260 y 280 nm. La reacción de síntesis de ADNc de primera cadena se llevó a cabo con 500 ng de ARN purificado utilizando un kit Fast Quant RT (con gDNasa) según el protocolo del fabricante (TIANGEN, China).

En el presente estudio se detectaron genes específicos de la superóxido dismutasa, incluyendo (sod) 1 (sod-1), sod-3 y catalasa 2 (ctl-2). Los datos se analizaron utilizando el método 2-ΔΔCt, como se informó anteriormente (Zhou et al., 2016), y las expresiones de ARNm se normalizaron sobre la base del ARNm act-1. Para cada gen analizado, se realizó un análisis de qRT-PCR por triplicado (réplicas técnicas).

Análisis estadístico

Para realizar todos los análisis estadísticos se utilizó el software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versión 12 (International Business Machines Corp., Nueva York, EE.UU.). Se comprobó la normalidad de todos los datos y se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para determinar la distribución normal y no normal. Se utilizó un ANOVA de una vía para analizar los niveles de significación de las diferencias entre tratamientos. Los gráficos y las figuras se realizaron con GraphPad Prism 6 (San Diego, California, EE.UU.).

Resultados y discusión

GO NPs Letalidad

En el presente estudio se evaluó a C. elegans mediante una serie de criterios de valoración toxicológica, como la letalidad, la reproducción, la locomoción, la vida útil y el estrés oxidativo (expresión génica de sod-1, sod-3 y clt-2). Este estudio es la primera vez que se utilizan dosis bajas de GO NP (aproximadamente al menos 1000 veces menores que las utilizadas en los estudios anteriores) para examinar la nanotoxicidad en un modelo de C. elegans. Se realizó una exposición desde las larvas L1 hasta el adulto joven para evaluar los efectos de la exposición prolongada al GO tanto en las larvas como en los nematodos adultos. Como se muestra en la Fig. 1, la tasa de supervivencia de los nematodos tras la exposición prolongada al GO no indicó efectos letales significativos. No se observaron diferencias significativas entre grupos en cuanto a la mortalidad en el grupo de control y en el grupo tratado con concentraciones que iban de 0,00100 a 1,00 μg L-1.

Pocos estudios han examinado la toxicidad aguda de las NP de GO en modelos N2 de C. elegans (Wu et al., 2013, 2014; Li et al., 2019). Wu et al. (2013) indicaron que no se observó letalidad en concentraciones de NP de GO de 0,100 a 100 mg L-1 después de que los gusanos fueran expuestos de forma aguda o prolongada a estos ENMs basados en carbono. Por el contrario, un estudio que examinó la toxicidad aguda con el tratamiento de altas dosis de 5, 10, 50 y 100 mg L-1 de NPs de GO en nematodos encontró que las concentraciones de GO superiores a 5 mg L-1 pueden causar letalidad, donde ningún gusano sobrevivió a una dosis de 100 mg L-1 (Li et al., 2017).

Wu et al. (2014) también examinaron niveles bajos de PN GO de 0,00100 a 1,00 mg L-1 y no encontraron diferencias significativas en cuanto a la letalidad, excepto en el caso de la concentración más alta de 1,00 mg L-1, después de que los nematodos fueran expuestos crónicamente a estos ENM basados en el carbono desde la larva L1 hasta el día 8 de adulto. La mayoría de los estudios de GO NP hacen referencia al estudio de Wu (Wu et al., 2013) y utilizan niveles de dosificación similares (niveles de ppm) para examinar la toxicidad neurológica, reproductiva, neuroconductual e inmunológica, así como las respuestas inflamatorias.

Figur 1
Fig. 1. Tasas de supervivencia de C. elegans tras una exposición prolongada a NPs de GO en concentraciones de 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 y el control sin tratar. Las barras se muestran como media ± SD. Las diferencias significativas se expresaron como * p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.

 

Toxicidad reproductiva de las NPs de GO

La reproducción en los nematodos es un punto final vital porque se ha demostrado que es sensible a concentraciones más bajas de estresores químicos que las que perjudican el comportamiento y la viabilidad de los nematodos (Wu et al., 2019). Los resultados de la Fig. 2 muestran que la exposición prolongada a las NPs de GO en los nematodos redujo la producción del tamaño de la cría. Se observó una disminución significativa en el número de progenie a concentraciones de 0,0100 (p = 0,036), 0,100 (p = 0,008) y 1,00 (p < 0,001) µg L-1 de NPs de GO. Las tasas de reducción del tamaño de la cría en estas tres concentraciones en comparación con el grupo de control fueron de 15,2, 20,1 y 27,3%, respectivamente.

Los resultados mostraron que las concentraciones más altas de NPs de GO indujeron más toxicidad reproductiva en base a nuestros experimentos sobre el número de tamaño de las crías en los nematodos. Nuestros resultados fueron coherentes con la mayoría de los estudios sobre las nanopartículas de GO que informan de que la exposición a las nanopartículas de GO puede causar efectos adversos al dañar la fertilidad y el comportamiento de expulsión de huevos de los nematodos (Wu et al., 2013; Zhao et al., 2016a; Kim et al., 2018; Rive et al., 2019). Wu et al. (2013) mostraron que C. elegans con una exposición prolongada a 1-100 mg L-1 exhibió una disminución significativa del tamaño de la cría en comparación con el control, pero no hubo diferencias significativas entre grupos a 0,1 y 0,5 mg L-1. También se encontró un resultado similar en un estudio anterior (Rive et al., 2019), indicando que la exposición prolongada a NPs de GO a 100 y 200 mg L-1 disminuyó significativamente las tasas de puesta de huevos en comparación con el control no tratado.

Kim et al. (2018) revelaron que la acumulación de NPs de GO (10 mg L-1) en los órganos reproductivos, que podría ser la causa directa de la toxicidad reproductiva, podría reducir el tamaño de la cría y el recuento de espermatozoides mediante la supresión de la espermatogénesis de los nematodos hermafroditas en los niveles de GO de 5 o 10 mg L-1. Sin embargo, el impacto negativo de la exposición al GO NP en la función reproductiva en el presente estudio y en otros publicados (Wu et al., 2013; Zhao et al., 2016a; Kim et al., 2018; Rive et al., 2019), así como nuestros resultados, sugieren que la exposición prolongada al GO NPs a dosis bajas de 0,0100 a 1,00 µg L-1 podría disminuir el número de progenie o la fecundidad en modelos N2 C elegans.

Figur 2
Fig. 2. Efectos del tamaño de la cría en C. elegans tras una exposición prolongada a las NPs de GO en concentraciones de 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 y el control sin tratar. Las barras se muestran como media ± SD. Las diferencias significativas se expresaron como *p < 0,05, ** p < 0,01 y ***p < 0,001.

 

La exposición al GO NP afecta al comportamiento de las locomotoras

Los ensayos de comportamiento locomotor son métodos bien establecidos para estudiar la neurotoxicidad de los nematodos. Tras una exposición prolongada, el GO indujo disminuciones evidentes tanto en el golpeo de la cabeza como en la flexión del cuerpo de los nematodos (Fig. 3). En el examen del golpeo de la cabeza, las concentraciones de 0,0100, 0,100 y 1,00 µg L-1 de nanopartículas de GO disminuyeron significativamente el golpeo de la cabeza en 12,0, 5,41 y 19,8%, respectivamente, en comparación con el control no tratado. Además, la flexión del cuerpo se redujo significativamente a 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 µg L-1 de NPs de GO en 8,78, 21,2, 31,5 y 40,8%, respectivamente, en comparación con los grupos de control.

Nuestros resultados fueron consistentes con los de la mayoría de los artículos publicados, lo que implica que la exposición al GO NP daña las funciones neurológicas y altera negativamente el comportamiento de tronar la cabeza y doblar el cuerpo (Wu et al., 2013, 2014; Zhao et al., 2015, 2016c; Chen et al., 2017; Li et al., 2017; Qu et al., 2017; Kim et al., 2018; Rive et al., 2019; Zhao et al., 2020). En el informe de Wu (Wu et al., 2014), la locomoción de la cabeza y la flexión del cuerpo se redujo significativamente a niveles de 0,0100, 0,100 y 1,00 mg L-1 en comparación con un control no tratado. Li et al. (2017) indicaron que la exposición prolongada a las NPs de GO (5,00-100 mg L-1) redujo significativamente la flexión del cuerpo, el batido de la cabeza, la frecuencia de bombeo de la faringe, la velocidad media, la frecuencia del ángulo de flexión y la longitud de onda del movimiento de arrastre de los nematodos. Las NPs de GO también indujeron daños en las neuronas dopaminérgicas y glutamatérgicas de los nematodos (Li et al., 2017).

Kim et al. (2020) también propusieron que el GO se acumuló significativamente en las regiones de la cabeza, generó la inducción de ROS, redujo las sustancias neurotransmisoras en las neuronas dopaminérgicas y glutamatérgicas, y dañó las neuronas AFD, que son los principales termosensores en C. elegans, después de que los nematodos fueran expuestos a NPs de GO (10 mg L-1). En un estudio coreano, Kim et al. (2018) también encontraron que los neurotransmisores, como la dopamina, el ácido γ-aminobutírico (GABA), la tiramina, el triptófano y la tirosina, se redujeron en los nematodos expuestos a las NPs de GO. Según los datos actuales, incluido el presente estudio (Wu et al., 2013, 2014; Zhao et al., 2015, 2016a; Chen et al., 2017; Li et al., 2017; Qu et al., 2017; Kim et al., 2018; Rive et al., 2019; Zhao et al, 2020), se ha llegado a la conclusión de que la exposición a NPs de GO causa efectos adversos en el sistema neurológico de C. elegans, particularmente en términos de daño a las neuronas, influencias en las alteraciones de los neurotransmisores y retrasos en el desarrollo neuroconductual. En el presente estudio, se utilizaron niveles ambientales (0,0100-1,00 µg L-1) de dosis de GO NP para tratar a los nematodos con el fin de determinar el impacto negativo en su comportamiento de locomoción.

Figura 3
Fig. 3. Efectos de la agitación de la cabeza y de la flexión del cuerpo en los nematodos tras una exposición prolongada a las NPs de GO en concentraciones de 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 y el control no tratado. Las barras se muestran como media ± SD. Las diferencias significativas se expresaron como *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.

 

Efecto de las NPs de GO en la vida útil

En los modelos de C. elegans, la duración de la vida es un punto final importante para la evaluación de los tóxicos. Tras una exposición prolongada en los nematodos, las NPs de GO en concentraciones de 0,00100-1,00 µg L-1 dieron lugar a una vida más corta que la de los controles no tratados (Fig. 4). Varios indicadores de la vida útil, incluyendo la vida media (Fig. 4(b)), el día medio de la muerte de la mediana (percentil 50) (Fig. 4(c)), el día medio de la muerte del percentil 75 (Fig. 4(d)), el día medio de la muerte del percentil 95 (Fig. 4(e)) y el día de todas las muertes (Fig. 4(a)) indicaron una longevidad significativamente mayor en el control no tratado en comparación con los nematodos expuestos a las NPs GO (p < 0,001). La vida media y el día de todas las muertes fueron de 13,9, 7,01, 6,23, 6,94 y 6,35 días en el control no tratado y 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 µg L-1, respectivamente, y de 20, 16, 14, 14 y 16 días en el control no tratado y 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 µg L-1, respectivamente. Después de 6 días, el porcentaje de supervivencia de los nematodos disminuyó hasta 50% de la población total.

También se observó que los nematodos tratados con NPs de GO mostraron una reducción más rápida de la vida útil que el grupo de control. En resumen, la Fig. 4 indica que la exposición prolongada a las NPs de GO reduce la vida útil de los nematodos (p < 0,001). Según los datos actuales de informes anteriores (Zhang et al., 2012; Zhao et al., 2016b, 2016c; Qu et al., 2017; Rive et al., 2019), se obtuvieron resultados contradictorios, donde dos estudios indicaron que la exposición a GO NP, incluyendo la exposición aguda y prolongada no tuvo efectos sobre la longevidad (Zhang et al, 2012; Rive et al., 2019), y otros estudios obtuvieron resultados diferentes indicando que los gusanos con exposición prolongada a las NP de GO exhibieron una longevidad significativamente reducida (Zhao et al., 2016b, 2016c; Qu et al., 2017) a concentraciones de NP de GO entre 1,00 y 200 mg L-1. Dos mecanismos moleculares de señalización de la insulina intestinal pueden estar involucrados en la longevidad acortada de los nematodos expuestos a una concentración de GO NP de 100 mg L-1 debido a la asociación con la supresión de las funciones de DAF-16 y sod-3 (Zhao et al., 2016b). Según nuestros resultados, la dosis baja de 0,00100 µg L-1 redujo significativamente la longevidad de los nematodos.

Figura 4
Fig. 4. Vida útil de C. elegans tras una exposición prolongada a NPs de GO a niveles de 0,00100, 0,0100, 0,100 y 1,00 µg L-1 y el control (a) evaluación nanotóxica de gusanos con exposición prolongada a GO para la vida útil, (b) vida útil media, (c) día medio de muerte del percentil 50, (d) día medio de muerte del percentil 75 y (e) día medio de muerte del percentil 95. Las barras se muestran como media ± DE. Las diferencias significativas se expresaron como *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.
Expresión génica tras la exposición a las nanopartículas GO

Los genes sod codifican las superóxido dismutasas (SOD), que comprenden un sistema antioxidante para C. elegans contra el estrés oxidativo después de la exposición al GO NP (Ren et al., 2018). Las SODs que existen en tres isoformas de sod1, sod2 y sod-3 son una clase de la proteína antioxidante. En la Fig. 5 se muestra el aumento de pliegues en la expresión de los genes sod-1, sod-3 y ctl-2 inducidos después de que C. elegans se sometiera a una exposición prolongada a 0,00100, 0,100 y 1,00 µg L-1 de GO NP en comparación con el control no tratado. Las expresiones activadas de sod-1, sod-3 y ctl-2 a las concentraciones de 0,00100, 0,100 y 1,00 µg L-1 en los C. elegans expuestos a GO NP fueron significativamente mayores que las del control no tratado. La SOD es una enzima clave en la función de desintoxicación de los radicales libres.

Eliminó los radicales libres generados por las NPs de GO en fuentes extracelulares en los nematodos. Resultados similares a los encontrados en el presente estudio también se encontraron en estudios anteriores (Wu et al., 2013; Zhao et al., 2016b), lo que indica que las NPs GO podrían inducir la activación de sod-1 o sod-3. Los hallazgos del estudio de Wu sugieren que el estrés oxidativo inducido en los nematodos tratados con NP de GO puede estar relacionado con cambios en las actividades de SOD (Wu et al., 2013). Sobre la base de estos hallazgos, se puede inferir que el estrés oxidativo es un posible mecanismo que causa efectos adversos en el neurodesarrollo y el desarrollo neuroconductual después de la exposición prolongada a GO NP, como se sugiere en informes anteriores (Wu et al., 2013; Zhao et al., 2016b), en combinación con los resultados de la activación de SOD inducida y la neurotoxicidad en los nematodos expuestos a GO en el presente estudio (Figs. 3 y 5).

Además, la activación de sod-1, sod-3 y ctl-2 puede estar asociada a la menor longevidad de los gusanos expuestos al GO, según las Figs. 4 y 5. En el estudio de Zhou (Zhou et al., 2016), el gen ctl-2 de C. elegans, que codifica la catalasa peroxisomal, se relacionó con el estrés oxidativo ambiental después de que los gusanos fueran expuestos al bisfenol A. Pocos estudios han abordado la relación entre la expresión de ctl-2 y la exposición a GO en C. elegans. Aunque en el presente estudio se demostró una asociación positiva entre la expresión de ctl-2 y la exposición al GO NP, el mecanismo aún no está claro.

Figur 5
Fig. 5. Expresión génica en C. elegans con exposición prolongada a NPs de GO a los niveles del control sin tratar, 0,00100, 0,100 y 1,00 µg L-1 (a) SOD-1 (C15F1.7), (b) SOD-3 (C08A9.1) y (c) ctl-2 (Y54G11A.5); Actina-1 (T04C12.6) como control interno. Las barras se muestran como media ± SD. Las diferencias significativas se expresaron como *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.

Finalmente, se concluyó en el presente estudio que dosis extremadamente bajas de NPs de GO, comparadas con las dosis discutidas en artículos publicados recientemente, pueden causar toxicidad reproductiva y neuroconductual e inducir incrementos de varias veces la expresión de los genes sod-1, sod-3 y clt-2. Cabe destacar que en el presente estudio se evaluaron los efectos potencialmente tóxicos de los niveles ambientales de las NPs GO en modelos in vivo de C. elegans para mostrar los impactos negativos en la reproducción, el desarrollo neuroconductual y el estrés oxidativo. Por lo tanto, se reitera que, sobre la base de nuestros hallazgos, las NPs de GO a niveles ambientales pueden causar efectos crónicamente tóxicos.

Conclusiones

Es la primera vez que se utiliza la baja dosis de NPs de GO tratadas en el modelo in vivo para encontrar los efectos adversos en los nematodos. Basándonos en nuestros hallazgos, la exposición prolongada a las NPs GO provoca efectos reproductivos, genera neurotoxicidad, acorta la longevidad e induce estrés oxidativo en C. elegans. Se reitera que las dosis bajas de NPs de GO a niveles ambientales de 0,00100 a 1,00 µg L-1 causaron impactos significativamente negativos en los nematodos, en contraste con los datos actuales publicados. Por lo tanto, los efectos adversos de las NPs GO de bajo nivel en la salud humana deben ser evaluados en el futuro.

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