Ποια είναι τα συμπεράσματα της μελέτης βραχυπρόθεσμης εισπνοής των νανοπλακών οξειδίου του γραφενίου


Nano

Τα οξείδια του γραφενίου διαθέτουν μοναδικές φυσικοχημικές ιδιότητες με σημαντικές πιθανές εφαρμογές στην ηλεκτρονική, τη φαρμακευτική και την ιατρική.

Τοξικότητα του οξειδίου του γραφενίου κατά την εισπνοή

Ωστόσο, η τοξικότητα μετά από έκθεση σε οξείδιο του γραφενίου μέσω εισπνοής δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε βραχυπρόθεσμη ανάλυση της τοξικότητας του οξειδίου του γραφενίου κατά την εισπνοή με τη χρήση ενός συστήματος εισπνοής μόνο από τη μύτη και αρσενικών αρουραίων Sprague-Dawley.

Συνολικά τέσσερις ομάδες (15 αρουραίοι ανά ομάδα) εκτέθηκαν σε: (1) έλεγχος (καθαρός αέρας), (2) χαμηλή συγκέντρωση (0,76 ± 0,16 mg/m3), (3) μέτρια συγκέντρωση (2,60 ± 0,19 mg/m3) και (4) υψηλή συγκέντρωση (9,78 ± 0,29 mg/m3). Οι αρουραίοι εκτέθηκαν σε οξείδιο του γραφενίου για 6 ώρες/ημέρα για 5 ημέρες, ακολουθούμενες από περιόδους αποκατάστασης 1, 3 και 21 ημερών.

Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στο βάρος του σώματος ή των οργάνων μετά από βραχυπρόθεσμη έκθεση ή κατά την περίοδο αποκατάστασης. Ομοίως, δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές συστηματικές επιδράσεις τοξικολογικής σημασίας σε αιματολογικές δοκιμασίες, δείκτες φλεγμονής στο υγρό βρογχοκυψελιδικού καθαρισμού (BAL), κυτταροκίνες στο υγρό BAL ή βιοχημικές δοκιμασίες αίματος μετά την έκθεση σε οξείδιο του γραφενίου ή κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης μετά την έκθεση.

Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη διαφοροποίηση των κυττάρων του BAL, όπως τα λεμφοκύτταρα, τα μακροφάγα ή τα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα. Στους πνεύμονες όλων των ομάδων συγκέντρωσης παρατηρήθηκαν κυψελιδικά μακροφάγα φορτισμένα με οξείδιο του γραφενίου ως αυθόρμητη απόκριση κάθαρσης από 1 έως 21 ημέρες μετά την έκθεση.

Η ιστοπαθολογική εξέταση του ήπατος και των νεφρών δεν αποκάλυψε σημαντικές ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις σχετικές με το είδος της δοκιμής. Είναι σημαντικό ότι, παρόμοια με προηγούμενες αναφορές σχετικά με την εισπνοή γραφενίου, παρατηρήθηκε ελάχιστη ή ανεπαίσθητη τοξικότητα του οξειδίου του γραφενίου στους πνεύμονες και σε άλλα όργανα σε αυτή τη βραχυπρόθεσμη μελέτη εισπνοής που διεξήχθη μόνο μέσω της μύτης.

Εισαγωγή

Το γραφένιο ορίζεται ως ένα ενιαίο στρώμα ατόμων άνθρακα, με κάθε άτομο να συνδέεται με τρία γειτονικά του άτομα σε δομή κηρήθρας (ISO TS 80004-3, 2010). Στην περίπτωση του οξειδίου του γραφενίου (GO), οι λειτουργικές ομάδες εποξειδίου (1,2-αιθέρα) και υδροξυλίου είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένες σε κάθε πλευρά του βασικού επιπέδου, ενώ οι καρβοξυλικές ομάδες βρίσκονται στα άκρα (Balapanuru et al., 2010).

Αυτό το ισχυρό και ελαφρύ νανοϋλικό αναμένεται να χρησιμοποιηθεί σε πολλούς βιομηχανικούς τομείς, συμπεριλαμβανομένων των βιοϊατρικών εφαρμογών, της ηλεκτρονικής, της ενέργειας και των αισθητήρων, αλλά αυτό εγείρει επίσης ανησυχίες σχετικά με την έκθεση του ανθρώπου και τους περιβαλλοντικούς και επαγγελματικούς κινδύνους (Sanchez et al., 2012- Yang et al., 2015- Lee et al., 2016- Park et al., 2017).

Η επαγγελματική έκθεση σε νανοϋλικά γραφενίου μπορεί να συμβεί στον αέρα κατά τη διάρκεια της παραγωγής νανοϋλικών γραφενίου μέσω διαδικασιών οξείδωσης και αναγωγής και οι εκτεθειμένες μορφές μπορεί να περιλαμβάνουν μεμονωμένα νανοπλακίδια γραφενίου, συσσωματώματα ή συσσωματώματα (Lee et al., 2016).

Το οξείδιο του γραφενίου (πλευρικό μέγεθος 200-500 nm) έχει βρεθεί προηγουμένως να προκαλεί κυτταροτοξικότητα και γονιδιοτοξικότητα σε ινοβλάστες ανθρώπινων πνευμόνων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (1-100 μm/ml), με το οξειδωτικό στρες και το επιφανειακό φορτίο του οξειδίου του γραφενίου να φαίνεται ότι μεσολαβούν στην τοξικότητα (Wang et al., 2013).

Σε κυτταρικό επίπεδο, το οξείδιο του γραφενίου (160 - 780 nm) δεν διείσδυσε στα κύτταρα A549, αλλά προκάλεσε οξειδωτικό στρες με δοσοεξαρτώμενο τρόπο και οδήγησε σε μικρή απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι το οξείδιο του γραφενίου είναι ένα σχετικά ασφαλές υλικό (Chang et al., 2011).

Επιπλέον, οι ενέσεις οξειδίου του γραφενίου στις ουραίες φλέβες αρουραίων για 7 ημέρες σε συγκεντρώσεις 2,5, 5 και 10 mg/kg σωματικού βάρους δεν προκάλεσαν αλλαγές στη συμπεριφορά σε πειράματα πεδίου και σε δοκιμές λειτουργικής μπαταρίας παρατήρησης, αλλά προκάλεσαν φλεγμονή στους πνεύμονες, στο ήπαρ και στον σπλήνα σε υψηλή συγκέντρωση (10 mg/kg). Οι ενέσεις οξειδίου του γραφενίου μείωσαν επίσης τα επίπεδα χοληστερόλης, λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL) και λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας (Li et al., 2016).

Μια άλλη μελέτη σχετικά με την οξεία εισπνευστική τοξικότητα του οξειδίου του γραφενίου έδειξε επίσης ότι η οξεία εισπνευστική έκθεση σε οξείδιο του γραφενίου σε συγκεντρώσεις 0,46 και 3,76 mg/m3 προκάλεσε ελάχιστες τοξικές αντιδράσεις στους πνεύμονες αρσενικών αρουραίων Sprague-Dawley χωρίς αύξηση των φλεγμονωδών δεικτών (Han et al., 2015).

Ανεξάρτητα από αυτό, η επιφανειακή αντιδραστικότητα, το μέγεθος και η κατάσταση διασποράς των νανοϋλικών γραφενίου παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόκληση τοξικότητας και βιοδιανομής των νανοϋλικών γραφενίου.

Επιπλέον, το οξειδωτικό στρες και η πρόκληση φλεγμονώδους αντίδρασης είναι επίσης σημαντικά για την πρόκληση τοξικότητας που σχετίζεται με τη βιοδιανομή των νανοϋλικών γραφενίου (Ema et al., 2017).

Επομένως, παρά τις διάφορες μελέτες σχετικά με την οξεία τοξικότητα του οξειδίου του γραφενίου από την εισπνοή, δεν έχει υπάρξει καμία μελέτη σχετικά με την επαναλαμβανόμενη τοξικότητα του οξειδίου του γραφενίου από την εισπνοή, η οποία είναι πιο σημαντική για την αξιολόγηση των κινδύνων από την επαναλαμβανόμενη έκθεση σε νανοϋλικά γραφενίου στον χώρο εργασίας.

Κατά συνέπεια, η παρούσα μελέτη συνέλεξε τα απαραίτητα δεδομένα για την αξιολόγηση της ασφάλειας του οξειδίου του γραφενίου, συμπεριλαμβανομένης της πνευμονικής τοξικότητας, της συστηματικής τοξικότητας μέσω της αιματολογίας, της βιοχημείας του αίματος και της ιστοπαθολογίας στα κύρια όργανα μετά από έκθεση 5 ημερών και μετά από διάφορες περιόδους μετά την έκθεση.

Υλικά και μέθοδοι

Χαρακτηρισμός του οξειδίου του γραφενίου

Η νανοσκόνη οξειδίου του γραφενίου (GO-A200, IGH20160414, πάχος 1~2 ατομικό στρώμα) που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα παραχωρήθηκε από την Grapheneall Co. (Gwinsean-gu, Suwon-si, Gyeonggi-do, Νότια Κορέα). Χαρακτηρίστηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες της νανοσκόνης οξειδίου του γραφενίου, συμπεριλαμβανομένων της περιεκτικότητας σε στοιχεία, του πλευρικού μεγέθους, του πάχους, του λόγου D/G, της κρυσταλλικότητας και της αγωγιμότητας.

Η περιεκτικότητα σε στοιχεία προσδιορίστηκε με θερμοβαρυμετρική ανάλυση (TG/DTA 7300, Seiko Inc., Chiba, Ιαπωνία) και φασματογράφο μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS, Agilent Technologies 7300, Santa Clara, CA), ο λόγος D/G προσδιορίστηκε με φασματοσκοπία Raman (WITec alpha 300, Ulm, Γερμανία), η δομική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με περιθλασίμετρο ακτίνων Χ Rigaku Ultima IV (Τόκιο, Ιαπωνία), το δυναμικό ζήτα μετρήθηκε με Malvern ZS90, He-Ne 633 laser (Ηνωμένο Βασίλειο) ,το ιξώδες μετρήθηκε με ιξωδόμετρο (PCE RVI 6, Southampton Hampshire, Ηνωμένο Βασίλειο), η επιφάνεια μετρήθηκε με BELSOPR-min II (MicrotracBEL, Osaka, Ιαπωνία) με τη μέθοδο Brunauer-Emmett-Teller και το πάχος των στρωμάτων γραφενίου αναλύθηκε με μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM, Park System NX 10, Seoul, Korea).

Τα αερολύματα οξειδίου του γραφενίου συλλέχθηκαν σε πλέγμα TEM (πλέγμα χαλκού, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) και αναλύθηκαν με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου εκπομπής ηλεκτρονίων μετάδοσης πεδίου (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japan) με EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) σε τάση επιτάχυνσης 200 kV (NIOSH 1994). και το πάχος των στρωμάτων γραφενίου αναλύθηκε με μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM, Park System NX 10, Seoul, Korea). Τα αερολύματα οξειδίου του γραφενίου συλλέχθηκαν σε πλέγμα TEM (πλέγμα χαλκού, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) και αναλύθηκαν με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου εκπομπής ηλεκτρονίων μετάδοσης πεδίου (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japan) με EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) σε τάση επιτάχυνσης 200 kV (NIOSH 1994). και το πάχος των στρωμάτων γραφενίου αναλύθηκε με μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM, Park System NX 10, Seoul, Korea).

Τα αερολύματα οξειδίου του γραφενίου συλλέχθηκαν σε πλέγμα TEM (πλέγμα χαλκού, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) και αναλύθηκαν με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου εκπομπής ηλεκτρονίων μετάδοσης πεδίου (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japan) με EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) σε τάση επιτάχυνσης 200 kV (NIOSH 1994). UK) σε τάση επιτάχυνσης 200 k V (NIOSH 1994).UK) σε τάση επιτάχυνσης 200 k V (NIOSH 1994).

Παραγωγή αερολύματος

Οι αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley (SD) εκτέθηκαν σε νανοσκόνη οξειδίου του γραφενίου για 5 ημέρες χρησιμοποιώντας ένα σύστημα έκθεσης Nase-only (HCT, Icheon, Κορέα). Η νανοσκόνη οξειδίου του γραφενίου δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας έναν ψεκαστήρα (AG-01, HCT, Icheon, Κορέα) ( Πίνακας S1) με καθαρισμένο αέρα ως φέρον αέριο.

Ο καθαρός αέρας χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος, ενώ διαφορετικά εναιωρήματα νερού χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία διαφορετικών αερολυμάτων: 0,04 mg/ml για χαμηλή συγκέντρωση, 0,19 mg/ml για μεσαία συγκέντρωση και 0,77 mg/ml για υψηλή συγκέντρωση. Η ροή του αέρα διατηρήθηκε στα 30 λίτρα ανά λεπτό (l/min) χρησιμοποιώντας έναν ελεγκτή ροής μάζας (MFX, FX-7810CD-4V, AERA, Τόκιο, Ιαπωνία) και ο ρυθμός ροής σε κάθε ρουθούνι ήταν 1 l/min. Η παροχή εναλλασσόμενου ρεύματος διατηρήθηκε στα 99,56 ± 0,07 V (μέσος όρος ± SE). Οι συγκεντρώσεις-στόχοι της νανοσκόνης οξειδίου του γραφενίου ήταν 0,625, 2,5 και 10 mg/m 3 για τις χαμηλές, μεσαίες και υψηλές συγκεντρώσεις, αντίστοιχα.

Η μέση αεροδυναμική διάμετρος μάζας (MMAD) μετρήθηκε με τη χρήση ενός MOUDI 125NR (cascade impactor, MSP Co, Shoreview, MN) με ρυθμό ροής 10 l/min. Σε κάθε στάδιο χρησιμοποιήθηκε φίλτρο από φύλλο αλουμινίου επικαλυμμένο με γράσο για την ελαχιστοποίηση της αναπήδησης των σωματιδίων. Η μάζα του αερολύματος που συλλέχθηκε στα φίλτρα προσδιορίστηκε ως η διαφορά μεταξύ του βάρους μετά και του βάρους πριν από τα φίλτρα. Η γεωμετρική τυπική απόκλιση (GSD) της κατανομής προέκυψε από την αθροιστική κατανομή μάζας των φίλτρων.

Παρακολούθηση του αερολύματος οξειδίου του γραφενίου στο θάλαμο εισπνοής

Η κατανομή του μεγέθους των σωματιδίων μετρήθηκε με τη χρήση συσκευής παρακολούθησης σκόνης (μοντέλο 1.1.09, Grimm Technologies Inc. Douglasville, GA) και συσκευής σάρωσης νανοσωματιδίων (SMPS, HCT Co., Ltd., Icheon, Korea). Η συγκέντρωση μάζας του οξειδίου του γραφενίου προσδιορίστηκε βαρυμετρικά (ως βάρος μετά το βάρος μείον βάρος πριν το βάρος) με δειγματοληψία σε φίλτρο PVC (χλωριούχο πολυβινύλιο, μέγεθος: 37 mm και μέγεθος πόρων 5,0 μm) με ρυθμό ροής 1,0 L/min.

Ανάλυση στοιχειακού άνθρακα

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε στοιχειακό άνθρακα (EC) στα αερολύματα οξειδίου του γραφενίου, χρησιμοποιήθηκαν επίσης φίλτρα χαλαζία (φίλτρα ινών χαλαζία διαμέτρου 37 mm, SKC Inc., Eighty-Four, PA, USA) για τη συλλογή των ολικών αιωρούμενων σωματιδίων (TSP) και την ανάλυση της συγκέντρωσης EC. Τα φίλτρα χαλαζία αναλύθηκαν στη συνέχεια για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης μάζας EC στον αέρα.

Τα φίλτρα αναλύθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο 5040 του Εγχειριδίου Αναλυτικής Μεθόδου (NMAM) της NIOSH ( NIOSH, 2003 ) , η οποία συνιστάται επί του παρόντος από τη NIOSH για την αξιολόγηση της έκθεσης σε CNT και νανοΐνες άνθρακα (CNF) ( NIOSH, 2013). Μια ανάλυση οργανικού άνθρακα (OC) χρησιμοποιείται επίσης συνήθως για τον χαρακτηρισμό των ανθρακούχων νανοϋλικών καθώς και των ανθρακούχων προσμίξεων σε κατασκευασμένα νανοϋλικά (ENM). Στην παρούσα μελέτη, το όριο αναφοράς ποσοτικοποίησης (LOQ) για τον EC, τον οργανικό άνθρακα και τον ολικό άνθρακα ήταν 2 μg, 2 μg και 4 μg/φίλτρο, αντίστοιχα, και το όριο ανίχνευσης (LOD) ήταν 0,6 μg/φίλτρο για κάθε κατηγορία αναλύσεων.

Ζώα και συνθήκες

Οι αρσενικοί αρουραίοι SD ηλικίας έξι εβδομάδων, απαλλαγμένοι από ειδικά παθογόνα, προμηθεύτηκαν από την OrientBio (Seongnam, Κορέα) και εγκλιματίστηκαν για δύο εβδομάδες πριν από την έναρξη της έκθεσης σε εισπνοή. Κατά τη διάρκεια του εγκλιματισμού και της έκθεσης στην εισπνοή, οι αρουραίοι διατηρήθηκαν σε περιβάλλον ελεγχόμενης θερμοκρασίας (22 ± 0,83 °C) και υγρασίας (47 ± 0,69%) με κύκλο φωτός-σκοταδιού 12 ωρών. Οι αρουραίοι τρέφονταν με τροφή τρωκτικών (Woojung BSC, Suwon, Κορέα) και φιλτραρισμένο νερό ad libitum. Κατά τη διάρκεια της περιόδου εγκλιματισμού, τα ζώα εκπαιδεύτηκαν για 6 ώρες/ημέρα για να προσαρμοστούν στο θάλαμο εισπνοής μόνο με τη μύτη.

Οι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες: (n=15), χαμηλή συγκέντρωση (n=15), μεσαία συγκέντρωση (n=15) και υψηλή συγκέντρωση (n=15). Οι ομάδες χαμηλής, μεσαίας και υψηλής συγκέντρωσης εκτέθηκαν σε νανοσκόνη οξειδίου του γραφενίου 6 ώρες/ημέρα για 5 ημέρες, ενώ η ομάδα ελέγχου έλαβε φιλτραρισμένο καθαρό αέρα. Τα ζώα εξετάζονταν καθημερινά για ενδείξεις τοξικών αντιδράσεων που σχετίζονται με την έκθεση. Το σωματικό βάρος μετρήθηκε κατά την αγορά, την ομαδοποίηση, μία φορά κατά τη διάρκεια της εισπνοής και πριν από τη μεταθανάτια σφαγή.

Η πρόσληψη τροφής (g/ποντίκι/ημέρα) μετρήθηκε μία φορά την εβδομάδα. Μετά τις 5 ημέρες έκθεσης σε οξείδιο του γραφενίου, οι αρουραίοι είχαν περιθώριο 1, 3 και 21 ημέρες (n = 5 ανά ομάδα θεραπείας για κάθε περίοδο) για να εξετάσουν την κάθαρση. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου Hanyang.

Βάρη οργάνων, συνολική παθολογία και ιστοπαθολογία

Μετά τη συλλογή αίματος, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε ευθανασία με το αναισθητικό Entobar ® και ακολούθησε προσεκτική αφαίρεση των όρχεων, της καρδιάς, του θύμου, της τραχείας, των πνευμόνων, των νεφρών, του σπλήνα, του ήπατος και του εγκεφάλου. Τα όργανα εξετάστηκαν για ακαθάριστες αλλοιώσεις και στη συνέχεια ζυγίστηκαν και στερεώθηκαν σε διάλυμα φορμόλης 10% που περιείχε ουδέτερο φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά άλατα (PBS).

Για την ιστοπαθολογική αξιολόγηση, οι όρχεις σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα Bouin κατά τη θανάτωση, ενώ ο αριστερός πνεύμονας σταθεροποιήθηκε σε διάλυμα φορμόλης 10% (BBC Biochemical, Washington, DC) που περιείχε ουδέτερο ρυθμισμένο με φωσφορικό άλας υπό πίεση νερού 25 cm. Μετά τη σταθεροποίηση των οργάνων σε φυσικό PBS 10% για μία εβδομάδα, στη συνέχεια ενσωματώθηκαν σε κηροζίνη και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (BBC biochemical, Washington, DC). Όλα τα όργανα των ζώων εξετάστηκαν με φωτεινή μικροσκοπία. Ο αριστερός πνεύμονας χωρίστηκε σε τρία μέρη και εξετάστηκε.

Αιματολογία και βιοχημεία αίματος

Μετά από ενδοπεριτοναϊκή ένεση του αναισθητικού Entobar ® (1 ml/kg) και πριν από την ευθανασία, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από την κοιλιακή αορτή σε σωληνάρια EDTA για αιματολογική εξέταση και σε σωληνάρια διαχωρισμού για τον προσδιορισμό της βιοχημείας του αίματος.

Το αίμα αναλύθηκε με τη χρήση αναλυτή αίματος (Hitachi 7108, Hitachi, Τόκιο, Ιαπωνία), ενώ η αιματολογία αναλύθηκε με τη χρήση μετρητή κυττάρων αίματος (Hemavet 0950, CDC Tech., Dayton, OH). Η πήξη του αίματος αναλύθηκε με τη χρήση εξοπλισμού πήξης αίματος (ACL700, Instrumentation Laboratory, Bedford, MA).

Ανάλυση κυττάρων βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (BAL) και μέτρηση φλεγμονωδών δεικτών και κυτταροκινών στο υγρό BAL

Κατά τη θυσία, οι δεξιοί πνεύμονες εγχύθηκαν τέσσερις φορές με 3 ml ζεστού αλατούχου διαλύματος χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο (PBS) (pH 7,4). Στη συνέχεια, τα υγρά BAL φυγοκεντρήθηκαν στα 500 × g για 7 λεπτά και τα κύτταρα BAL συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 1 ml PBS για αξιολόγηση. Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση αιμοκυτταρομέτρου. Τα κύτταρα αρχικά επιχρίστηκαν και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Wright Giemsa Sure Stain για να καταστεί δυνατή η καταμέτρηση των ολικών κυττάρων, των μακροφάγων, των πολυμορφοπύρηνων κυττάρων (PMN) και των λεμφοκυττάρων.

Διακόσια κύτταρα αξιολογήθηκαν για κυτταρική διαφοροποίηση. Επιπλέον, τα δείγματα BAL αναλύθηκαν επίσης με τη χρήση βιοχημικού αναλυτή αίματος (Hitachi 7108, Hitachi, Ιαπωνία) για τον προσδιορισμό των επιπέδων της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), της μικροαλβουμίνης (mALB), της μικροολικής πρωτεΐνης (mTP) και του αζώτου ουρίας στο αίμα (BUN). Οι συγκεντρώσεις των φλεγμονωδών κυτταροκινών (TNF-α, IL-1β) στο BAL υγρό προσδιορίστηκαν με τη χρήση ανοσοδοκιμασίας Quantikine Rat IL-1β/IL-1F2 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) και ανοσοδοκιμασίας Quantikine Rat TNF-α . μετρήθηκαν (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (αρχή: ανοσοδοκιμασία ενζύμου σάντουιτς).

Εναπόθεση στον πνεύμονα και υπολογισμός δόσης

Η ημερήσια έκθεση των πνευμόνων ανά αρουραίο εκτιμήθηκε για 6 ώρες συνεχούς έκθεσης, 1 λεπτό αερισμού 0,19 l/min ( Whalan et al., 2006 ) και τις ακόλουθες ιδιότητες του αερολύματος (βλ. ενότητα Αποτελέσματα) : σωματίδιο 203 nm MMAD, 2,01 GSD , 15,36% αποτελεσματικότητα εναπόθεσης στους πνεύμονες με βάση το μοντέλο MPPD (2002) (Multiple-Path Particle Dosimetry) Model v.2.0 και συγκεντρώσεις αερολύματος οξειδίου του γραφενίου 0,76, 2,60 και 9,78 mg/m 3 για τη χαμηλή, τη μεσαία και την υψηλή συγκέντρωση, αντίστοιχα.

Έγιναν οι ακόλουθοι υπολογισμοί:

  • Αποτιθέμενη ημερήσια δόση (mg/ημέρα) = μέση συγκέντρωση αερολύματος οξειδίου του γραφενίου (mg/m 3 ) × όγκος λεπτού (l/min = 0,06 m 3 /h) × διάρκεια έκθεσης (h/ημέρα) × απόδοση απόθεσης (1).
  • Απόθεση χαμηλής δόσης = 0,76 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,008 mg/ημέρα
  • Μέτρια εναπόθεση δόσης = 2,60 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,027 mg/ημέρα
  • Απόθεση υψηλής δόσης = 9,78 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,103 mg/ημέρα
  • Αθροιστική δόση (mg)/ζώο = κατατιθέμενη ημερήσια δόση (mg/ημέρα) × αριθμός ημερών (5).
  • Για χαμηλή έκθεση: 0,008 × 5 = 0,04 mg
  • Για μέτρια έκθεση: 0,027 × 5 = 0,135 mg
  • Σε υψηλή έκθεση: 0,103 × 5 = 0,515 mg
Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση των παραμέτρων έκβασης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SPSS έκδοση 19 (SPSS Inc., Chicago, IL). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) μετά από δοκιμές πολλαπλών συγκρίσεων με τη μέθοδο Dunnett's T3. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε σε p < 0,05, p < 0,01.

Αποτελέσματα

Ιδιότητες της νανοσκόνης οξειδίου του γραφενίου

Οι φυσικοχημικές ιδιότητες της νανοσκόνης οξειδίου του γραφενίου παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 και στο Σχήμα 1. Η περιεκτικότητα σε άνθρακα και οξυγόνο ήταν 42-45% και 35-40%, αντίστοιχα, με βάση τη θερμοβαρυμετρική ανάλυση (TGA), ενώ οι προσμίξεις ήταν μαγγάνιο <0,001% και θείο <2,0%, με βάση τη φασματομετρία οπτικής εκπομπής πλάσματος επαγωγικά συζευγμένου ( ICP-OES). Το πάχος του οξειδίου του γραφενίου ήταν περίπου 1 nm με 1-2 ατομικά στρώματα και το πλευρικό μέγεθος ήταν της τάξης των 0,5 έως 5 μm.

Η ανάλυση ΤΕΜ εκπομπής πεδίου της νανοσκόνης οξειδίου του γραφενίου μετά τη δημιουργία αερολύματος αποκάλυψε μια στοιβαγμένη δομή πλακιδίων με διάφορα πάχη που κυμαίνονται από 5,94 έως 209,1 nm (Σχήμα 2). Επιπλέον, η ανάλυση TEM-EDS αποκάλυψε την παρουσία δύο στοιχείων (δηλ. C και O) (Σχήμα 2). Στον πίνακα 2 παρουσιάζονται τα ατομικά ποσοστά των κύριων συστατικών του οξειδίου του γραφενίου με βάση την ανάλυση EDS: άνθρακας (72,69%), οξυγόνο (27,31%).

Abb1
Σχ. 1 Φυσικοχημικές ιδιότητες του οξειδίου του γραφενίου. XPS, φασματοσκοπία φωτοηλεκτρονίων ακτίνων Χ- XRD, περίθλαση ακτίνων Χ- TGA, θερμοβαρυμετρική ανάλυση- FT-IR, φασματοσκοπία υπερύθρου μετασχηματισμού Fourier- UV-vis, φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατού.
Abb2
Σχ. 2 Ανάλυση του οξειδίου του γραφενίου με FE-TEM (AD) (ηλεκτρονική μικροσκοπία εκπομπής ηλεκτρονίων πεδίου) (×100.000). (EF) φασματογράφος EDS (φασματοσκοπία ενεργειακής διασποράς).

Corona 1

Corona 3

 

Θάλαμος παρακολούθησης και κατανομή οξειδίου του γραφενίου

Οι στοχευόμενες συγκεντρώσεις μάζας της νανοσκόνης οξειδίου του γραφενίου ήταν 0,625 mg/m 3, 2,5 mg/m 3 και 10 mg/m 3 για τις χαμηλές, μεσαίες και υψηλές συγκεντρώσεις, αντίστοιχα. Οι συγκεντρώσεις μάζας που παραδόθηκαν στους θαλάμους χαμηλής, μεσαίας και υψηλής συγκέντρωσης ήταν 0,76 ± 0,10, 2,60 ± 0,19 και 9,78 ± 0,29 mg/m 3. (Πίνακας 3), αντίστοιχα. Οι συγκεντρώσεις αριθμού στους θαλάμους, που μετρήθηκαν με οπτικό μετρητή σωματιδίων (OPC), ήταν 3,25 × 10 3 ± 1,18 × 10 2, 6,30 × 10 3 ± 2,90 × 10 2 και 9,97 × 10 3 ± 1,68 × 10 3 σωματίδια/ cm 3 για τις χαμηλές, μεσαίες και υψηλές συγκεντρώσεις, αντίστοιχα (Πίνακας 3). Οι συγκεντρώσεις αριθμού σωματιδίων διατηρήθηκαν όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.

Η κατανομή του μεγέθους των σωματιδίων στους θαλάμους μετρήθηκε με τη χρήση ενός σαρωτή σωματιδίων κινητικότητας (SMPS) (εύρος 5,94 nm - 224,7 nm) και OPC (εύρος 265 nm - 34 μm). Το SMPS έδειξε κορυφή στα 22,5 nm, 25 nm και 25,9 nm για τις χαμηλές, μεσαίες και υψηλές συγκεντρώσεις, αντίστοιχα (Σχήμα 4Α), ενώ το OPC έδειξε κορυφή στα 265 nm, 365 nm και 375 nm, αντίστοιχα (Σχήμα 4Β). Η διάμεση αεροδυναμική διάμετρος μάζας (MMAD) που μετρήθηκε με έναν καταιονιστικό κρουστήρα 13 σταδίων MOUDI 125NR ήταν 203 nm με GSD 2,01 (Σχήμα 5).

Figur 3
Σχήμα 3: Συγκεντρώσεις αριθμού σωματιδίων σε αερολύματα οξειδίου του γραφενίου σε θαλάμους εισπνοής κατά τη διάρκεια έκθεσης 5 ημερών που μετρήθηκαν με τον μετρητή σωματιδίων σάρωσης (SMPS) (Α) και τον οπτικό μετρητή σωματιδίων (OPC) (Β).
Figur 4
Σχήμα 4: Κατανομή μεγέθους σωματιδίων αερολυμάτων οξειδίου του γραφενίου σε θαλάμους εισπνοής που μετρήθηκαν με SMPS (Α) και OPC (Β). Οι κατανομές ήταν διποδικές, με μέγιστα κορυφής στα 20-30 nm (SMPS) και 300-400 nm (OPC), όπως φαίνεται στον πίνακα 3.
Abb 5
Σχήμα 5: Μέση αεροδυναμική διάμετρος μάζας (MMAD) (203 nm) και γεωμετρική τυπική απόκλιση (GSD) (2,01) του αερολυμένου οξειδίου του γραφενίου που μετρήθηκε με MOUDI.

tisch 3

Ανάλυση στοιχειακού άνθρακα

Η συνολική EC ήταν 0,18 ± 0,20 mg/cm 2, 1,56 ± 0,54 mg/cm 2, 3,34 ± 0,71 mg/cm 2 και 7,25 ± 1,14 mg/cm 2 για τους θαλάμους ελέγχου, χαμηλής, μέσης και υψηλής συγκέντρωσης, αντίστοιχα (Πίνακας 4).

tabelle 4

Παρατήρηση ζώων, πρόσληψη τροφής και επίδραση στο βάρος σώματος και οργάνων

Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές ακαθάριστες επιδράσεις κατά τη διάρκεια της έκθεσης. Επίσης, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές απώλειες σωματικού βάρους ή αλλαγές στην πρόσληψη τροφής κατά τη διάρκεια των περιόδων έκθεσης και αποκατάστασης ( Πίνακας S2 και 3 ). Ωστόσο, το βάρος του δεξιού πνεύμονα ήταν σημαντικά υψηλότερο (P < 0,05) για την υψηλή συγκέντρωση μετά από 1 ημέρα, γεγονός που υποδηλώνει περαιτέρω επαλήθευση της φλεγμονής μέσω ιστοπαθολογίας και αναλύσεων των κυττάρων BAL και του υγρού BAL ( Πίνακας S4 ).

Ιστοπαθολογία

Ενώ ο αριθμός των κυψελιδικών μακροφάγων με προσλαμβανόμενο οξείδιο του γραφενίου αυξήθηκε με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (Σχήμα 6), παρατηρήθηκε σταδιακή απομάκρυνση του οξειδίου του γραφενίου κατά την περίοδο 21 ημερών μετά την έκθεση. Ανεξάρτητα από αυτό, ορισμένα μακροφάγα με προσλαμβανόμενο γραφένιο εξακολουθούσαν να παραμένουν την 21η ημέρα της περιόδου μετά την έκθεση (Εικόνα 6, κόκκινα βέλη).

Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές ιστοπαθολογικές παρατηρήσεις στο περιφερικό επιθήλιο των αεραγωγών, στον διάμεσο ιστό, στον κυψελιδικό χώρο ή στο αγγειακό σύστημα του ήπατος και των νεφρών. Η παρατήρηση με φωτομικροσκόπιο δεν αποκάλυψε σαφείς ενδείξεις μετακίνησης των μακροφάγων που προσλαμβάνονται από οξείδιο του γραφενίου σε λεμφαδένες που γειτνιάζουν με τους βρόγχους. Επιπλέον, δεν υπήρξε σημαντική ιστοπαθολογική αντίδραση του πνευμονικού παρεγχύματος και ακόμη και σε χαμηλή μεγέθυνση παρατηρήθηκε αποκλειστικά προσαρμοστική αντίδραση της κάθαρσης των πνευμονικών μακροφάγων (Εικόνα 7). Η ιστοπαθολογική εξέταση του ήπατος και των νεφρών δεν αποκάλυψε σημαντικές αλλοιώσεις που να οφείλονται στο αντικείμενο δοκιμής.

Abb 6
Εικόνα 6: Ιστοπαθολογία των πνευμόνων σε 1, 3 και 21 ημέρες. Οι πίνακες είναι οργανωμένοι ως ημέρα μετά την έκθεση σε σχέση με τη συγκέντρωση. Μεγέθυνση 400x. Καμία από τις μικρογραφίες δεν έδειξε φλεγμονή στα βρογχιόλια ή στις περιαγγειακές περιοχές. Δεν υπήρχαν ινωτικοί κυτταρικοί πολλαπλασιασμοί στους διάμεσους ιστούς. Τα μακροφάγα με προσλαμβανόμενο οξείδιο του γραφενίου ανιχνεύθηκαν με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση. Δεν παρατηρήθηκε καμία κοκκιωματώδης εμφάνιση σε διάφορες συγκεντρώσεις καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου μετά την έκθεση. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν μακροφάγα με προσλαμβανόμενο οξείδιο του γραφενίου.
Abb 7
Εικόνα 7: Ιστοπαθολογία των πνευμόνων μετά από 1, 3 και 21 ημέρες. Οι πίνακες δείχνουν μικροσκοπικές εικόνες ελέγχου και υψηλής συγκέντρωσης σε χαμηλή μεγέθυνση (100x). Καμία από τις μικροσκοπικές εικόνες δεν δείχνει φλεγμονή στα βρογχιόλια ή στις περιαγγειακές περιοχές ή στο πνευμονικό παρέγχυμα. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν μακροφάγα με προσλαμβανόμενο οξείδιο του γραφενίου.
Μέτρηση φλεγμονωδών δεικτών και κυτταροκινών

Η διαφορική μέτρηση των κυττάρων στο BAL δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές στον συνολικό αριθμό των κυττάρων, των μακροφάγων, των λεμφοκυττάρων ή των PMN (Πίνακας 5). Όταν οι φλεγμονώδεις βιοδείκτες BAL συγκρίθηκαν με την ομάδα ελέγχου, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του mTP την ημέρα 3 μετά την έκθεση για την ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης.

Και πάλι, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, όλες οι ομάδες που εκτέθηκαν παρουσίασαν σταθερή σημαντική μείωση της mALB σε κάθε χρονική στιγμή μετά την έκθεση, αλλά καμία σημαντική μεταβολή της BUN ή της LDH. (Πίνακας 6). Επιπλέον, το υγρό BAL δεν παρουσίασε σημαντικές μεταβολές στις κυτταροκίνες IL-1β ή TNF-α κατά την περίοδο μετά την έκθεση (Πίνακας 6).

tabelle 5

tabelle 6

Επίδραση στην πήξη του αίματος

Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, καμία από τις ομάδες που εκτέθηκαν δεν παρουσίασε καμία μεταβολή στους δείκτες πήξης του αίματος PT και APTT κατά την περίοδο των 21 ημερών μετά την έκθεση (Πίνακας 7).

tabelle 7

Αιματολογία και βιοχημεία αίματος

Η μέση συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης (MCHC) παρουσίασε σημαντική μείωση (P < 0,01) στην ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης μετά από 1 ημέρα ( Πίνακας S7 ). Επιπλέον, η MCHC παρουσίασε μείωση (P < 0,05) στις ομάδες μέσης και υψηλής συγκέντρωσης μετά από 3 ημέρες, αλλά αύξηση (P < 0,05) στην ομάδα υψηλής συγκέντρωσης μετά από 21 ημέρες ( Πίνακας S8-9 ). Ο μέσος όγκος αιμοπεταλίων (MPV) παρουσίασε αύξηση (P < 0,01) στην ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης μετά από 1 ημέρα ( Πίνακας S7 ) .

Το ποσοστό των μη χρωματισμένων κυττάρων (LUC) αυξήθηκε επίσης (P < 0,01) στην ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης μετά από 1 ημέρα και αυξήθηκε (P < 0,05) στις ομάδες χαμηλής και μέσης συγκέντρωσης μετά από 3 ημέρες ( Πίνακας S7-8) . Ο απόλυτος αριθμός των μεγάλων μη χρωματισμένων κυττάρων (abs luc) αυξήθηκε (P < 0,05) στην ομάδα μέσης συγκέντρωσης μετά από 3 ημέρες ( Πίνακας S8 ). Ενώ η LUC παρουσίασε μια σταθερή τάση σημαντικών αυξήσεων σε όλα τα χρονικά σημεία μετά την έκθεση, οι αλλαγές αυτές ήταν όλες εντός του φυσιολογικού εύρους των τιμών αριθμητικού ελέγχου για αυτό το τελικό σημείο.

Η ομάδα μέσης συγκέντρωσης παρουσίασε χαμηλότερα επίπεδα χοληστερόλης (CHO) σε σύγκριση με την ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης (p < 0,05) ( Πίνακας S10 ). Το επίπεδο κρεατίνης (CRE) μειώθηκε επίσης (P < 0,05 - 0,01) στις ομάδες μέσης και υψηλής συγκέντρωσης μετά από 1 ημέρα ( Πίνακας S10 ). Τα ανόργανα φωσφορικά άλατα (IP) μειώθηκαν σημαντικά (P < 0,05 - 0,01) σε όλες τις εκτεθειμένες ομάδες μετά από 1 ημέρα και στις ομάδες μέσης και υψηλής συγκέντρωσης (P < 0,05) μετά από 3 ημέρες ( Πίνακας S10-11 ). Το επίπεδο της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) μειώθηκε (P < 0,05) στην ομάδα υψηλής συγκέντρωσης μετά από 1 ημέρα και μειώθηκε (P < 0,01) στις ομάδες μέσης και υψηλής συγκέντρωσης μετά από 3 ημέρες ( Πίνακας S10-11 ). Η ομάδα υψηλής συγκέντρωσης παρουσίασε επίσης χαμηλότερο επίπεδο LDH από την ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης (p < 0,05) ( Πίνακας S10 ).

Το επίπεδο μαγνησίου (MG) μειώθηκε (P < 0,01) στις ομάδες μέσης και υψηλής συγκέντρωσης μετά από 1 ημέρα και μειώθηκε (P < 0,01) στις ομάδες χαμηλής, μέσης και υψηλής συγκέντρωσης μετά από 3 ημέρες. Η ομάδα μέσης και υψηλής συγκέντρωσης παρουσίασε επίσης χαμηλότερο MG από την ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης (P < 0,01) ( Πίνακας S 10-12 ). Το επίπεδο των τριγλυκεριδίων (TG) αυξήθηκε (p < 0,01) στην ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης μετά από 1 ημέρα και αυξήθηκε (p < 0,01) στην ομάδα υψηλής συγκέντρωσης μετά από 3 ημέρες ( Πίνακας S10-11) . Ενώ τα επίπεδα TG παρουσίασαν σταθερές σημαντικές αυξήσεις σε όλες τις χρονικές στιγμές μετά την έκθεση, οι μεταβολές αυτές ήταν εντός του φυσιολογικού εύρους των τιμών αριθμητικού ελέγχου.

Το επίπεδο της γλουταμινικής οξειδωτικής τρανσαμινάσης (GOT) μειώθηκε (P < 0,01) στην ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης μετά από 1 ημέρα και αυξήθηκε (P < 0,01) στην ομάδα υψηλής συγκέντρωσης μετά από 3 ημέρες ( Πίνακας S11 ). Η ομάδα υψηλής συγκέντρωσης παρουσίασε επίσης χαμηλότερη GOT σε σύγκριση με την ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης (p < 0,05) ( Πίνακας S10 ). Το επίπεδο κινάσης της κρεατίνης (CK) μειώθηκε στην ομάδα μέσης και υψηλής συγκέντρωσης μετά από 3 ημέρες (P < 0,01) ( Πίνακας S11 ). Το επίπεδο νατρίου (Na) μειώθηκε στην ομάδα χαμηλής συγκέντρωσης μετά από 3 ημέρες (P < 0,05) ( Πίνακας S11).

Τα επίπεδα αλβουμίνης (ALB) και αλκαλικής φωσφατάσης (ALP) μειώθηκαν στις ομάδες μέσης και χαμηλής συγκέντρωσης, αντίστοιχα, μετά από 21 ημέρες (P < 0,05) ( Πίνακας S12 ). Τα επίπεδα γλυκόζης (GLU) αυξήθηκαν στις ομάδες μέσης και υψηλής συγκέντρωσης μετά από 21 ημέρες (P < 0,01) ( Πίνακας S12 ). Ωστόσο, ενώ παρατηρήθηκαν σταθερές σημαντικές αυξήσεις των IP, GOT, LDH, MG, CK σε όλα τα χρονικά σημεία μετά την έκθεση, οι μεταβολές αυτές ήταν όλες εντός του φυσιολογικού εύρους των αριθμητικών τιμών ελέγχου ( Πίνακας S10-11 ). Κατά συνέπεια, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές επιδράσεις τοξικολογικής σημασίας στη νεφρική και ηπατική αιματολογική λειτουργία μετά από έκθεση σε οξείδιο του γραφενίου.

Συζήτηση

Οι όροι "ασφαλής καινοτομία" και "ασφαλής κατά το σχεδιασμό" χρησιμοποιούνται σήμερα ευρέως στον τομέα της νανοτεχνολογίας για να υποστηρίξουν τις εκτιμήσεις περί ασφάλειας σε πρώιμο στάδιο της διαδικασίας καινοτομίας των νανοϋλικών και των νανοκατασκευασμένων προϊόντων ( Park et al., 2017 ). Τα νανοϋλικά γραφενίου αποτελούν πράγματι ένα καλό παράδειγμα ασφαλούς καινοτομίας ή ασφαλούς από σχεδιασμό. Λόγω του έντονου ενδιαφέροντος για την εμπορική ανάπτυξη των νανοϋλικών που σχετίζονται με το γραφένιο και της αυξανόμενης τάσης παραγωγής, η αξιολόγηση των σχετικών κινδύνων πριν από την έναρξη της παραγωγής είναι πολύ σημαντική. Μια πρόσφατη ανασκόπηση των μελετών τοξικότητας νανοϋλικών με βάση το γραφένιο σε πειραματόζωα έδειξε πιθανές τοξικότητες συμπεριφοράς, αναπαραγωγής και ανάπτυξης και γονοτοξικότητες ( Ema et al., 2017 ).

Ενώ η οξεία εισπνευστική τοξικότητα του οξειδίου του γραφενίου έχει περιγραφεί ως χαμηλή ( Han et al, 2015 ), η επαναλαμβανόμενη εισπνευστική τοξικότητα του οξειδίου του γραφενίου δεν έχει ακόμη μελετηθεί. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη, η οποία βασίζεται στη βραχυπρόθεσμη μελέτη εισπνοής των Ma-hock et al (2009), αποτελεί ένα πρώτο βήμα για την αξιολόγηση της επικινδυνότητας και τον προσδιορισμό του εύρους για μελλοντικές υποοξείες και υποχρόνιες μελέτες. Κατά συνέπεια, με βάση τις αιματολογικές και βιοχημικές αναλύσεις μετά την έκθεση σε οξείδιο του γραφενίου και κατά τη διάρκεια μιας περιόδου παρατήρησης μετά την έκθεση, η παρούσα βραχυπρόθεσμη μελέτη εισπνοής δεν αποκάλυψε σημαντικές συστηματικές τοξικές επιδράσεις του οξειδίου του γραφενίου.

Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης παρόμοια τάση με μια προηγούμενη μελέτη υποξείας έκθεσης σε γραφένιο (Kim et al., 2016). Η ιστοπαθολογική εξέταση του ήπατος και των νεφρών δεν αποκάλυψε σημαντικές ιστοπαθολογικές αλλαγές σχετικές με το αντικείμενο δοκιμής. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στις διαφορές των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, όπως τα λεμφοκύτταρα, τα μακροφάγα και τα PMNs. Η αξιολόγηση των κυτταροκινών του υγρού BAL (δηλ. IL-1β,TNF-α) δεν έδειξε επίσης σημαντικές μεταβολές που εξαρτώνται από τη συγκέντρωση κατά τη διάρκεια της περιόδου μετά την έκθεση (Πίνακας 6). παρατηρήθηκε μια αυθόρμητη απόκριση κάθαρσης των κυψελιδικών μακροφάγων που προσλαμβάνονται από το οξείδιο του γραφενίου στους πνεύμονες όλων των ομάδων συγκέντρωσης καθ' όλη τη διάρκεια των 21 ημερών μετά την έκθεση.

Ο πίνακας 8 παρουσιάζει μια σύγκριση των αποτελεσμάτων τοξικότητας για το γραφένιο και το οξείδιο του γραφενίου σε διάφορες μελέτες βραχυπρόθεσμης και υποξείας εισπνοής με γραφένιο. Η βραχυπρόθεσμη μελέτη εισπνοής γραφενίου από τους Shin et al, 2015 και η υποξεία μελέτη εισπνοής γραφενίου από τους Kim et al, 2016 ανέφεραν σχεδόν πανομοιότυπα αποτελέσματα τοξικότητας με τη μελέτη οξείας εισπνοής οξειδίου του γραφενίου από τους Han et al, 2015 και την παρούσα βραχυπρόθεσμη μελέτη εισπνοής οξειδίου του γραφενίου. Ωστόσο, μια άλλη μελέτη φαρυγγικής αναρρόφησης νανοπλακών γραφενίου με πλευρικά μεγέθη < 2, 5 και 20 μm διαπίστωσε αυξημένους δείκτες φλεγμονής στα υγρά BAL όταν χρησιμοποιήθηκαν νανοπλακες γραφίτη μεγαλύτερες από 5 μm ( Roberts et al., 2016).

Αυτά τα διαφορετικά αποτελέσματα θα μπορούσαν να οφείλονται στην πλευρική κατανομή μεγέθους του γραφενίου και του οξειδίου του γραφενίου. Όταν το πλευρικό μέγεθος ήταν μικρότερο από 5 μm, τα κυψελιδικά μακροφάγα που απεικονίστηκαν με γραφένιο και οξείδιο του γραφενίου έδειξαν παρόμοια αποτελέσματα με ελάχιστη τοξικότητα. Ωστόσο, όταν το πλευρικό μέγεθος ήταν μεγαλύτερο από 5 μm, το γραφένιο προκάλεσε φλεγμονώδη αντίδραση στο BAL υγρό μετά την έκθεση ( Ma-hock et al., 2013 ). Στις μελέτες των Shin et al (2015) και Ma-hock et al (2013), τα ζώα εκτέθηκαν σε μέγιστο 3 μg/m 3 και 10 μg/m 3 μέσω εισπνοής σε νανοπλακίδια γραφενίου, αντίστοιχα, και αφέθηκαν να ανακάμψουν για 21 ημέρες. Ενώ τα αερολύματα των νανοπλακών γραφενίου είχαν παρόμοιο MMAD σε κάθε μελέτη, οι φλεγμονώδεις αντιδράσεις καθορίστηκαν από τα διαφορετικά πλευρικά μεγέθη των νανοπλακών γραφενίου.

Επιπλέον, οι διαφορετικές μέθοδοι χορήγησης μπορούν επίσης να επηρεάσουν τη φλεγμονώδη απόκριση. Η ενδοτραχειακή ενστάλαξη (Shinwald et al., 2012) ή οι τεχνικές φαρυγγικής αναρρόφησης για την παράδοση στους πνεύμονες αρουραίων ή ποντικών μπορεί να οδηγήσουν σε μεγαλύτερη συσσωμάτωση των νανοϋλικών και γενικά δεν αναπαράγουν με ακρίβεια τα πρότυπα εναπόθεσης που παρατηρούνται με την έκθεση σε εισπνοή σε ξηρά αερολυμένα ή νεφελοποιημένα αιωρήματα νανοϋλικών.

Η κύρια διαφορά είναι ότι η έκθεση με bolus (ενστάλαξη ή αναρρόφηση) είναι ένας μη φυσιολογικός τρόπος για την παροχή ενός υγρού αιωρούμενου υλικού μέσα σε κλάσματα του δευτερολέπτου με πολύ υψηλό ρυθμό δόσης.ενώ η φυσιολογική εισπνοή εναποθέτει αερολυμένα υλικά για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (ημέρες, εβδομάδες ή μήνες σε χαμηλούς ρυθμούς δόσης) (Oberdorster et al., 2015 ). Ως εκ τούτου, η φλεγμονώδης απόκριση που προκλήθηκε μετά από ενδοτραχειακή ενστάλαξη οξειδίου του γραφενίου και μειωμένου οξειδίου του γραφενίου σε ποντίκια με αυξημένη απόκριση οξείας φάσης μαζί με αμυλοειδές Α στον ορό ( Bengston et al., 2017 ) δεν παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη εισπνοής, η οποία δεν έδειξε έντονη φλεγμονώδη απόκριση.

tablle 8

Με βάση τη βραχυχρόνια μελέτη εισπνοής των συγγραφέων, ολοκληρώθηκε επίσης μια υποχρόνια μελέτη εισπνοής με νανοπλακίδια οξειδίου του γραφενίου και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα μακροφάγα είχαν προσλάβει σωματίδια σε μέτριες και υψηλές συγκεντρώσεις ως αυθόρμητη αντίδραση στην κάθαρση. Ως εκ τούτου, το προτεινόμενο NOAEL για την υποχρόνια μελέτη εισπνοής ήταν 3,02 mg/m 3 και δεν εντοπίστηκαν όργανα-στόχοι ( An et al., 2017 ).

Οι πρόσφατα αναθεωρημένες κατευθυντήριες γραμμές δοκιμών του ΟΟΣΑ για τις δοκιμές υποοξείας και υποχρόνιας τοξικότητας από εισπνοή απαιτούν πλέον ανάλυση της έκθεσης των πνευμόνων για την παροχή πληροφοριών σχετικά με την πνευμονική εναπόθεση και τη διατήρηση των σωματιδίων στους πνεύμονες στο τέλος της έκθεσης και σε διαστήματα παρατήρησης μετά την έκθεση ( OECD 2017a ; 2017b ). Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν μετρήσεις στοιχειακού άνθρακα (EC) του πνευμονικού ιστού από 1 ημέρα έως 21 ημέρες για την παροχή πληροφοριών σχετικά με την κάθαρση του οξειδίου του γραφενίου. Ωστόσο, δεν υπήρχε διαθέσιμη τεχνολογία για την ανάλυση EC από πνευμονικό ιστό. Αυτή η τεχνολογία έχει έκτοτε αναπτυχθεί από τους σημερινούς συγγραφείς και θα χρησιμοποιηθεί στις μελλοντικές μας μελέτες εισπνοής νανοϋλικών άνθρακα.

Αναφορές

  • An K, Lee S, Sung J, Kim H, Lee J, Song K, 2017. Eine 90-tägige subchronische Inhalationstoxizitätsstudie von Graphenoxidpulver bei F344-Ratten . Toxikologe 2727 [  ]
  • Balapanuru J, Yang JX, Xiao S, Bao Q, Jahan M, Polavarapu L, et al. 2010. Ein ionischer Komplex aus Graphenoxid und organischem Farbstoff mit DNA-sensorischen und optisch einschränkenden Eigenschaften . Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49 :6549-53. [ PubMed ] [  ]
  • Bengston S, Knudsen KB, Kyjovska ZO, Berthing T, Skaug V, Levin M, Koponen IK, Shivayogimath A, Booth TJ, Alonso B, Pesquera A, Zurutuza A, Thomsen B, Troelsen JT, Jacobsen NR, Vogel U, (2017 ) Unterschiede in der Entzündungs - und Akute - Phase - Reaktion , aber similar Genotoxizität bei Mäusen nach pulmonaler Exposition gegenüber Graphenoxid und reducedem Graphenoxid . PLOS one 12 ( 6 ): e0178355. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Chang Y, Yang ST, Liu JH, Dong E, Wang Y. 2011. In-vitro-Toxizitätsbewertung von Graphenoxid auf A549-Zellen . Toxikologiebriefe 200 : 201-210. [ PubMed ] [  ]
  • Ema M., Gamo M., Honda K. (2017). Eine Übersicht über Toxizitätsstudien zu Nanomaterialien auf Graphenbasis bei Versuchstieren . Regulatorische Toxikologie und Pharmakologie 85 ( 2017 ) 7-24 [ PubMed ] [  ]
  • Han SG, Kim JK, Shin JH, Hwang JH, Lee JS et al. 2015a. Lungenreaktionen von Sprague-Dawley-Ratten bei einmaliger inhalativer Exposition gegenüber Graphenoxid-Nanomaterialien . Biomed res Fat 2015 : 376756 [ PMC freier Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • ISO TS 80004-3, 2010. Nanotechnologien-Vokabular - Teil 3: Kohlenstoff- Nanoobjekte . STANDARD von Διεθνής Οργανισμός Τυποποίησης (Τεχνικό Πρότυπο)
  • Kim JK, Shin JH, Lee JS, Hwang JH, Lee JH, Beak JE, Kim TG, Kim BW, Kim SK, Lee GH, Ahn KH, Han SG, et al. 2015. 28-Tage-Inhalationstoxizität von Graphen-Nanoplättchen bei Sprague-Dawley-Ratten Nanotoxikologie [ PubMed ]
  • Lee JH, Han JH, Kim JH, Kim BW. 2016. Expositionsüberwachung von Arbeitsplätzen zur Herstellung von Graphen-Nanoplättchen Inhal Toxicol 28 ( 6 ): 281-91 [ PubMed ] [  ]
  • Li Y, Wang Y, Liu T, Chen Di, Luo Zhi. 2016. Subakute Toxizitätsstudie von Graphenoxid bei der Sprague-Dawley-Ratte . Int. J. Umwelt. Res. Public Health 13 , 1149. [ PMC-freier Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Ma-Hock L, Burkhardt S, Strauss V, Gamer AO, Wiench K, van Ravenzwaay B, Landsiedel R. 2009. Entwicklung eines Kurzzeit-Inhalationstests an der Ratte mit Nano-Titandioxid als Modellsubstanz . Inhaliere Toxicol 21 :102-18. [ PubMed ] [  ]
  • Ma-Hock L, Strauss V, Treumann S, Kuttler K, Wohlleben W, Hofmann T, et al. 2013. Vergleichende Inhalationstoxizität von mehrwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen, Graphen, Graphit-Nanoplättchen und Ruß mit geringer Oberfläche . Teil Fiber Toxicol 10 : 23. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Mercer RR, Scabilloni JF, Hubbs AF, Battelli LA, McKinney W, Friend S, et al. 2013. Verteilung und fibrotische Reaktion nach inhalativer Exposition gegenüber mehrwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen . Teil Fiber Toxicol 10 : 33. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Μοντέλο MPPD (Δοσιμετρία σωματιδίων πολλαπλών διαδρομών) v.2.0, 2002. ARA, NM. Nationales Toxikologieprogramm , US-Gesundheitsministerium,  ]
  • NIOSH (Nationales Institut für Arbeitssicherheit und Gesundheitsschutz). 2003. Εγχειρίδιο αναλυτικών μεθόδων (NMAM) Methode 5040: Elementarer Kohlenstoff . Cincinnati, OH: NIOSH. [  ]
  • NIOSH (Nationales Institut für Arbeitssicherheit und Gesundheitsschutz). 2013. Current Intelligence Bulletin 65: Berufliche Exposition gegenüber Kohlenstoff-Nanoröhrchen und -Nanofasern . Cincinnati, OH: NIOSH. [  ]
  • Oberdorster G, Castranova V, Asgharian B, Sayre P, (2015). Inhalative Exposition gegenüber Kohlenstoffnanoröhren (CNT) und Kohlenstoffnanofasern (CNF): Methodik und Dosimetrie . J Toxicol Environ Health B Crit Rev . 2015; 18 ( 0 ): 121-212. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • OECD (Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung), (2017a). OECD-Richtlinie für die Prüfung von Chemikalien: 28-tägige (subakute) Inhalationstoxizitätsstudie , OECD, Paris [  ]
  • OEC; D (Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung), (2017b). OECD-Leitlinie für die Prüfung von Chemikalien: 90-tägige (subchronische) Inhalationstoxizitätsstudie , OECD, Paris [  ]
  • Park MVDZ, Bleeker EAJ, Brand W, Casse FR, van Elk M, Gosens I, de Jong WH, Meesters JAJ, Peijnenburg WJGM, Quik JTK, Vandebriel RJ, Sips AJAM (2017). Überlegungen für sichere Innovation: Der Fall von Graphen . ACS Nano 11 : 8574-9593 [ PubMed ] [  ]
  • Roberts JR, Mercer RR, Stefaniak AB, Seehra MS, Geddam UK, Chaudhuri IS, Kyrlidis A, Kodali VK, Sager T, Kenyon A, Bilgesu SA, Eye T, Scabilloni JF, Leonard SS, Fix NR, Schwegler-Berry D, Farris BY, Wolfarth MG, Porter DW, Castranova V, Erdely A. 2016. Bewertung der pulmonalen und systemischen Toxizität nach Lungenexposition gegenüber Graphit-Nanoplatten: ein Mitglied der Graphen-basierten Nanomaterialfamilie . Span- und Faser Toxicology , 13 : 34. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Sanchez VC, Jachak A, Hurt RH, Kane AB. 2012. Biologische Wechselwirkungen von Nanomaterialien der Graphenfamilie: eine interdisziplinäre Übersicht . ChemRes Toxicol 25 :15-34. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Schinwald A, Murphy F, Askounis A. Koutsos V, Sefiane K. Minimale Oxidation und Inflammogenität von reinem Graphen mit Aufenthalt in der Lunge . Nanotoxikologie 8 ( 8 ): 824-832. [ PubMed ] [  ]
  • Shin JH, Han SG, Kim JK, Kim BW, Hwang JH, Lee JS et al. 2015. 5-tägige Studie mit wiederholter Inhalation und 28-tägiger Postexpositionsstudie von Graphen . Nanotoxikologie 9 :1023-31. [ PubMed ] [  ]
  • Anxin Wang, Pu Kefeng, Dong Bing, Liu Yang. 2013. Rolle der Oberflächenladung und des oxidativen Stresses bei der Zytotoxizität und Genotoxizität von Graphenoxid gegenüber menschlichen Lungenfibroblastenzellen [ PubMed ]
  • Whalan JE, Foureman GL, Vandenberg JJ. 2006. Inhalationsrisikobewertung bei der Umweltschutzbehörde In: Salem H, Katz SA, Hrsg. Inhalationstoxikologie . 2. Aufl. Boca Raton, FL: CRC Press, 26-8. [  ]
  • Yang S, Brüller ZS, Wu Z, Liu K, Parvez R, Dong F, Richard P, Samori X, Feng K, Müllen K. 2015. Organische Radikal-unterstützte elektrochemische Exfoliation für die skalierbare Produktion von hochwertigem Graphen . Marmelade. Chem.-Nr. Soc , 137 ( 43 ), S. 13927-13932 [ PubMed ] [  ]