Was sind die Schlussfolgerungen der Kurzzeit-Inhalationsstudie von Graphenoxid-Nanoplättchen?


Nano

Graphenoxide besitzen einzigartige physikalisch-chemische Eigenschaften, die wichtige Anwendungsmöglichkeiten in der Elektronik, Pharmazie und Medizin bieten.

Inhalationstoxizität von Graphen-Oxid

Die Toxizität nach inhalativer Exposition gegenüber Graphenoxid ist jedoch noch nicht geklärt. Daher wurde in dieser Studie eine Kurzzeitanalyse der Inhalationstoxizität von Graphenoxid mit einem reinen Naseninhalationssystem und männlichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt.

Insgesamt wurden vier Gruppen (15 Ratten pro Gruppe) exponiert: (1) Kontrolle (Frischluft), (2) geringe Konzentration (0,76 ± 0,16 mg/m3), (3) moderate Konzentration (2,60 ± 0,19 mg/m3) und (4) hohe Konzentration (9,78 ± 0,29 mg/m3). Die Ratten wurden 5 Tage lang 6 Stunden/Tag mit Graphenoxid exponiert, gefolgt von Erholungsphasen von 1, 3 und 21 Tagen.

Nach kurzfristiger Exposition oder während der Erholungsphase wurden keine signifikanten Veränderungen des Körper- oder Organgewichts beobachtet. Ebenso wurden keine signifikanten systemischen Wirkungen von toxikologischer Bedeutung in hämatologischen Tests, Entzündungsmarkern in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BAL), Zytokinen in BAL-Flüssigkeit oder biochemischen Bluttests nach Graphenoxid-Exposition oder während des Beobachtungszeitraums nach der Exposition festgestellt.

Darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede bei der Differenzierung von BAL-Zellen wie Lymphozyten, Makrophagen oder polymorphkernigen Zellen beobachtet. Mit Graphenoxid beladene alveoläre Makrophagen als spontane Clearance-Reaktion wurden in der Lunge aller Konzentrationsgruppen von 1 Tag bis 21 Tage nach der Exposition beobachtet.

Die histopathologische Untersuchung von Leber und Nieren ergab keine signifikanten histopathologischen Läsionen, die mit dem Prüfgegenstand in Zusammenhang stehen. Wichtig ist, dass ähnlich wie in früheren Berichten über die Inhalation von Graphen nur eine minimale oder nicht wahrnehmbare Toxizität von Graphenoxid in der Lunge und anderen Organen in dieser Kurzzeit-Inhalationsstudie, die nur über die Nase durchgeführt wurde, beobachtet wurde.

Einführung

Graphen ist definiert als eine einzelne Schicht von Kohlenstoffatomen, wobei jedes Atom mit drei Nachbarn in einer Wabenstruktur verbunden ist (ISO TS 80004-3, 2010). Im Fall von Graphenoxid (GO) sind die funktionellen Epoxid- (1,2-Ether) und Hydroxylgruppen auf jeder Seite der Basalebene kovalent gebunden, während sich die Carboxylgruppen an den Rändern befinden (Balapanuru et al., 2010).

Es wird erwartet, dass dieses starke und leichte Nanomaterial in vielen industriellen Bereichen eingesetzt wird, darunter biomedizinische Anwendungen, Elektronik, Energie und Sensoren, was jedoch auch Bedenken hinsichtlich der Exposition des Menschen sowie Umwelt- und Arbeitsrisiken aufwirft (Sanchez et al., 2012; Yang et al., 2015; Lee et al., 2016; Park et al., 2017).

Eine berufliche Exposition gegenüber Graphen-Nanomaterialien kann in der Luft während der Herstellung von Graphen-Nanomaterialien durch Oxidations- und Reduktionsprozesse auftreten, und die exponierten Formen können einzelne Graphen-Nanoplättchen, Aggregate oder Agglomerate umfassen (Lee et al., 2016).

Es wurde bereits festgestellt, dass Graphenoxid (200-500 nm laterale Größe) in menschlichen Lungenfibroblasten dosisabhängig (1-100 μm/ml) Zytotoxizität und Gentoxizität auslöst, wobei oxidativer Stress und die Oberflächenladung von Graphenoxid nachweislich die Toxizität vermitteln (Wang et al., 2013).

Auf zellulärer Ebene drang Graphenoxid (160 - 780 nm) nicht in A549-Zellen ein, verursachte aber dosisabhängig oxidativen Stress und führte nur bei hohen Konzentrationen zu einem leichten Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen, was darauf schließen lässt, dass Graphenoxid ein relativ sicheres Material ist (Chang et al., 2011).

Darüber hinaus verursachten Graphenoxid-Injektionen in die Schwanzvenen von Ratten über 7 Tage in Konzentrationen von 2,5, 5 und 10 mg/kg Körpergewicht keine Verhaltensänderungen in Feldexperimenten und funktionellen Beobachtungsbatterietests, verursachten aber bei einer hohen Konzentration (10 mg/kg) Entzündungen der Lunge, Leber und Milz. Graphenoxid-Injektionen verringerten auch die Cholesterin-, High-Density-Lipoprotein (HDL)- und Low-Density-Lipoprotein-Werte (Li et al., 2016).

Eine andere Studie zur akuten Inhalationstoxizität von Graphenoxid zeigte ebenfalls, dass eine akute Inhalationsexposition gegenüber Graphenoxid in Konzentrationen von 0,46 und 3,76 mg/m3 minimale toxische Reaktionen in der Lunge männlicher Sprague-Dawley-Ratten auslöste, ohne dass es zu einem Anstieg von Entzündungsmarkern kam (Han et al., 2015).

Unabhängig davon spielen die Oberflächenreaktivität, die Größe und der Dispersionsstatus von Graphen-Nanomaterialien eine wichtige Rolle bei der Induktion von Toxizität und der Biodistribution von Graphen-Nanomaterialien.

Darüber hinaus sind oxidativer Stress und die Induktion einer Entzündungsreaktion ebenfalls wichtig für die Induktion von Toxizität im Zusammenhang mit der Biodistribution von Graphen-Nanomaterialien (Ema et al., 2017).

Daher gibt es trotz mehrerer Studien über die akute Inhalationstoxizität von Graphenoxid keine Studie über die wiederholte Inhalationstoxizität von Graphenoxid, die für die Bewertung der Gefahren einer wiederholten Exposition gegenüber Graphen-Nanomaterialien am Arbeitsplatz wichtiger ist.

Dementsprechend wurden in dieser Studie die notwendigen Daten für eine Sicherheitsbewertung von Graphenoxid gesammelt, einschließlich Lungentoxizität, systemische Toxizität über Hämatologie, Blutbiochemie und Histopathologie in den wichtigsten Organen nach 5-tägiger Exposition und nach verschiedenen Zeiträumen nach der Exposition.

Materialien und Methoden

Charakterisierung von Graphene Oxide

Das in den Experimenten verwendete Graphenoxid-Nanopulver (GO-A200, IGH20160414; Dicke 1~2 Atomschichten) wurde von Grapheneall Co. (Gwinsean-gu, Suwon-si, Gyeonggi-do, Südkorea). Die physikochemischen Eigenschaften des Graphenoxid-Nanopulvers wurden charakterisiert, einschließlich seines Elementgehalts, seiner lateralen Größe, seiner Dicke, seines D/G-Verhältnisses, seiner Kristallinität und seiner Leitfähigkeit.

Die Elementgehalte wurden durch thermogravimetrische Analyse (TG/DTA 7300, Seiko Inc., Chiba, Japan) und mit einem induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometer (ICP-MS, Agilent Technologies 7300, Santa Clara, CA) bestimmt, das D/G-Verhältnis durch Raman-Spektroskopie (WITec alpha 300, Ulm, Deutschland) ermittelt, die Strukturanalyse mit einem Rigaku Ultima IV Röntgendiffraktometer (Tokio, Japan) durchgeführt, das Zeta-Potenzial mit einem Malvern ZS90, He-Ne 633 Laser (UK) gemessen, die Viskosität mit einem Viskosimeter (PCE RVI 6, Southampton Hampshire, UK) gemessen, die Oberfläche mit einem BELSOPR-min II (MicrotracBEL, Osaka, Japan) unter Verwendung der Brunauer-Emmett-Teller-Methode gemessen und die Dicke der Graphenschichten mit Rasterkraftmikroskopie (AFM, Park System NX 10, Seoul, Korea) analysiert.

Die Graphenoxid-Aerosole wurden auf einem TEM-Gitter (Kupfergitter, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) gesammelt und mit einem Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskop (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japan) mit einem EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV (NIOSH 1994) analysiert. und die Dicke der Graphenschichten mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM, Park System NX 10, Seoul, Korea) analysiert. Die Graphenoxid-Aerosole wurden auf einem TEM-Gitter (Kupfergitter, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) gesammelt und mit einem Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskop (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japan) mit einem EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV (NIOSH 1994) analysiert. und die Dicke der Graphenschichten mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM, Park System NX 10, Seoul, Korea) analysiert.

Die Graphenoxid-Aerosole wurden auf einem TEM-Gitter (Kupfergitter, Formvar/Carbon 200 mesh, TEDpella, CA) gesammelt und mit einem Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskop (FE-TEM, JEM2100F, JEOL, Tokyo, Japan) mit einem EDX (EDX, TM200, Oxford Instruments plc, Oxfordshire, UK) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV (NIOSH 1994) analysiert. UK) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV (NIOSH 1994).UK) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV (NIOSH 1994).

Aerosolerzeugung

Männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten wurden 5 Tage lang mit einem Nur-Nase-Expositionssystem (HCT, Icheon, Korea) bei Graphenoxid-Nanopulver exponiert. Das Graphenoxid-Nanopulver wurde mit einem Zerstäuber (AG-01, HCT, Icheon, Korea) ( Tabelle S1) mit gereinigter Luft als Trägergas erzeugt.

Frischluft diente als Kontrolle, während verschiedene Wassersuspensionen zur Erzeugung unterschiedlicher Aerosole verwendet wurden: 0,04 mg/ml für niedrige Konzentration, 0,19 mg/ml für mittlere Konzentration und 0,77 mg/ml für hohe Konzentration. Der Luftstrom wurde mit Hilfe eines Massendurchflussreglers (MFX, FX-7810CD-4V, AERA, Tokio, Japan) bei 30 Litern pro Minute (l/min) gehalten, und die Durchflussrate zu jedem Nasenloch betrug 1 l/min. Die Wechselstromversorgung wurde bei 99,56 ± 0,07 V (Mittelwert ± SE) gehalten. Die Zielkonzentrationen von Graphenoxid-Nanopulver betrugen 0,625, 2,5 und 10 mg/m 3 für die niedrigen, mittleren bzw. hohen Konzentrationen.

Der mittlere aerodynamische Massendurchmesser (MMAD) wurde mit einem MOUDI 125NR (Kaskadenimpaktor, MSP Co, Shoreview, MN) bei einer Durchflussrate von 10 l/min gemessen. In jeder Stufe wurde ein mit Fett beschichteter Aluminiumfolienfilter verwendet, um das Abprallen von Partikeln zu minimieren. Die auf den Filtern gesammelte Aerosolmasse wurde als Differenz zwischen dem Vor- und Nachgewicht der Filter bestimmt. Die geometrische Standardabweichung (GSD) der Verteilung wurde aus der kumulativen Massenverteilung der Filter abgeleitet.

Überwachung von Graphenoxid-Aerosol in der Inhalationskammer

Die Partikelgrößenverteilung wurde mit einem Staubmessgerät (Modell 1.1.09, Grimm Technologies Inc. Douglasville, GA) und einem Scanning Nanoparticle Sizer (SMPS, HCT Co., Ltd., Icheon, Korea) gemessen. Die Massenkonzentration von Graphenoxid wurde gravimetrisch (als Nachgewicht minus Vorgewicht) durch Probenahme auf einem PVC-Filter (Polyvinylchlorid, Größe: 37 mm und Porengröße 5,0 µm) bei einer Durchflussrate von 1,0 L/min bestimmt.

Elementare Kohlenstoffanalyse

Um den Gehalt an elementarem Kohlenstoff (EC) in den Graphenoxid-Aerosolen zu quantifizieren, wurden Quarzfilter (Quarzfaserfilter mit einem Durchmesser von 37 mm, SKC Inc., Eighty-Four, PA, USA) verwendet, um die gesamten Schwebeteilchen (TSP) zu sammeln und die EC-Konzentration zu analysieren. Die Quarzfilter wurden dann analysiert, um die Massenkonzentration von EC in der Luft zu bestimmen.

Die Filter wurden nach der Methode 5040 des NIOSH Manual of Analytical Method (NMAM) analysiert (NIOSH, 2003), die derzeit von NIOSH zur Bewertung der Exposition gegenüber CNT und Kohlenstoff-Nanofasern (CNF) empfohlen wird (NIOSH, 2013). Eine Analyse des organischen Kohlenstoffs (OC) wird ebenfalls routinemäßig zur Charakterisierung von kohlenstoffhaltigen Nanomaterialien sowie von kohlenstoffhaltigen Verunreinigungen in technisch hergestellten Nanomaterialien (ENM) verwendet. In dieser Studie lag die Bestimmungsgrenze (LOQ) für EC, organischen Kohlenstoff und Gesamtkohlenstoff bei 2 μg, 2 μg bzw. 4 μg/Filter und die Nachweisgrenze (LOD) bei 0,6 μg/Filter für jede Analytenkategorie.

Tiere und Bedingungen

Sechs Wochen alte männliche, spezifisch pathogenfreie SD-Ratten wurden von OrientBio (Seongnam, Korea) bezogen und zwei Wochen lang akklimatisiert, bevor die Inhalationsexposition eingeleitet wurde. Während der Akklimatisierung und der Inhalationsexposition wurden die Ratten in einer Umgebung mit kontrollierter Temperatur (22 ± 0,83 °C) und Luftfeuchtigkeit (47 ± 0,69%) und einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Ratten wurden mit Nagetierfutter (Woojung BSC, Suwon, Korea) und gefiltertem Wasser ad libitum gefüttert. Während der Eingewöhnungszeit wurden die Tiere 6 Stunden pro Tag trainiert, um sich an die reine Naseninhalationskammer zu gewöhnen.

Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe (n=15), niedrige Konzentration (n=15), mittlere Konzentration (n=15) und hohe Konzentration (n=15). Die Gruppen mit niedriger, mittlerer und hoher Konzentration wurden 5 Tage lang 6 Stunden/Tag Graphenoxid-Nanopulver ausgesetzt, während die Kontrollgruppe gefilterte Frischluft erhielt. Die Tiere wurden täglich auf Anzeichen von expositionsbedingten toxischen Reaktionen untersucht. Das Körpergewicht wurde zum Zeitpunkt des Erwerbs, der Gruppenzusammenstellung, einmal während der Inhalation und vor der Obduktion gemessen.

Die Futteraufnahme (g/Ratte/Tag) wurde einmal pro Woche gemessen. Nach der 5-tägigen Graphenoxid-Exposition hatten die Ratten 1, 3 und 21 Tage Zeit (n = 5 pro Behandlungsgruppe für jeden Zeitraum), um die Clearance zu untersuchen. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Hanyang Universität genehmigt.

Organgewichte, Gesamtpathologie und Histopathologie

Nach der Blutentnahme wurden die Ratten mit dem Narkosemittel Entobar ® euthanasiert, gefolgt von einer sorgfältigen Entfernung der Hoden, des Herzens, des Thymus, der Luftröhre, der Lunge, der Nieren, der Milz, der Leber und des Gehirns. Die Organe wurden auf grobe Läsionen untersucht und dann gewogen und in einer 10% Formalinlösung mit neutraler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert.

Für die histopathologische Beurteilung wurden die Hoden während der Tötung in einer Bouin-Lösung fixiert, während die linke Lunge in einer 10%-Formalinlösung (BBC Biochemical, Washington, DC) mit neutraler phosphatgepufferter Kochsalzlösung unter 25 cm Wasserdruck fixiert wurde. Nach der Fixierung der Organe in 10% natürlichem PBS für eine Woche wurden sie in Kerosin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin (BBC Biochemical, Washington, DC) gefärbt. Alle Tierorgane wurden lichtmikroskopisch untersucht. Die linke Lunge wurde in drei Teile geteilt und untersucht.

Hämatologie und Blutbiochemie

Nach einer intraperitonealen Injektion des Anästhetikums Entobar ® (1 ml/kg) und vor der Euthanasie wurden Blutproben aus der Bauchaorta in EDTA-Röhrchen für die hämatologische Untersuchung und in Trennröhrchen für die Bestimmung der Blutbiochemie entnommen.

Das Blut wurde mit einem Blutanalysegerät (Hitachi 7108, Hitachi, Tokio, Japan) analysiert, während die Hämatologie mit einem Blutzellenzähler (Hemavet 0950, CDC Tech., Dayton, OH) analysiert wurde. Die Blutgerinnung wurde mit einem Blutgerinnungsgerät (ACL700, Instrumentation Laboratory, Bedford, MA) analysiert.

Analyse der bronchoalveolären Lavage (BAL)-Zellen und Messung von Entzündungsmarkern und Zytokinen in der BAL-Flüssigkeit

Bei der Opferung wurde die rechte Lunge viermal mit 3 ml warmer calcium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) injiziert. Die BAL-Flüssigkeit wurde dann 7 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert, und die BAL-Zellen wurden gesammelt und zur Auswertung in 1 ml PBS resuspendiert. Die Gesamtzahl der Zellen wurde mit einem Hämozytometer bestimmt. Die Zellen wurden zunächst mit Ausstrichen und dann mit Wright Giemsa Sure Färbung gefärbt, um die Gesamtzellzahl, Makrophagen, polymorphkernige Zellen (PMN) und Lymphozyten zu bestimmen.

Zweihundert Zellen wurden auf ihre Zelldifferenzierung untersucht. Darüber hinaus wurden die BAL-Proben mit einem biochemischen Blutanalysegerät (Hitachi 7108, Hitachi, Japan) analysiert, um den Gehalt an Laktatdehydrogenase (LDH), Mikroalbumin (mALB), Mikro-Gesamtprotein (mTP) und Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) zu bestimmen. Die Konzentrationen entzündlicher Zytokine (TNF-α, IL-1β) in der BAL-Flüssigkeit wurden mit einem Quantikine Rat IL-1β/IL-1F2-Immunoassay (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) und einem Quantikine Rat TNF-α-Immunoassay (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt (Prinzip: Sandwich-Enzym-Immunoassay).

Lungendeposition und Dosisberechnung

Die tägliche Lungenexposition pro Ratte wurde für eine 6-stündige kontinuierliche Exposition, eine 1-minütige Belüftung von 0,19 l/min (Whalan et al., 2006) und die folgenden Aerosoleigenschaften (siehe Abschnitt Ergebnisse) geschätzt: 203 nm Partikel MMAD, 2,01 GSD, 15,36% Lungenablagerungseffizienz basierend auf dem MPPD (2002) (Multiple-Path Particle Dosimetry) Modell v.2.0 und Graphenoxid-Aerosolkonzentrationen von 0,76, 2,60 und 9,78 mg/m 3 für die niedrige, mittlere bzw. hohe Konzentration.

Die folgenden Berechnungen wurden durchgeführt:

  • Abgelagerte Tagesdosis (mg/Tag) = durchschnittliche Graphenoxid-Aerosolkonzentration (mg/m 3 ) × Minutenvolumen (l/min = 0,06 m 3 /h) × Expositionsdauer (h/Tag) × Ablagerungseffizienz (1).
  • Niedrig dosierte Ablagerung = 0,76 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,008 mg/Tag
  • Mäßige Ablagerung = 2,60 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,027 mg/Tag
  • Hochdosierte Ablagerung = 9,78 × (0,19 × 0,06) × 6 × 0,154 = 0,103 mg/Tag
  • Kumulative Dosis (mg)/Tier = hinterlegte Tagesdosis (mg/Tag) × Anzahl der Tage (5).
  • Bei geringer Exposition: 0,008 × 5 = 0,04 mg
  • Bei mittlerer Exposition: 0,027 × 5 = 0,135 mg
  • Bei hoher Exposition: 0,103 × 5 = 0,515 mg
Statistische Analyse

Die statistische Analyse der Ergebnisparameter wurde mit SPSS Version 19 (SPSS Inc., Chicago, IL) durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mittels Varianzanalyse (ANOVA) nach Mehrfachvergleichstests unter Verwendung der T3-Methode von Dunnett durchgeführt. Das statistische Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05, p < 0,01 festgelegt.

Ergebnisse

Eigenschaften von Graphenoxid-Nanopulver

Die physikochemischen Eigenschaften des Graphenoxid-Nanopulvers sind in Tabelle 1 und Abbildung 1 dargestellt. Der Kohlenstoff- und Sauerstoffgehalt betrug 42-45% bzw. 35-40%, basierend auf der thermogravimetrischen Analyse (TGA), während die Verunreinigungen Mangan <0,001% und Schwefel <2,0% waren, basierend auf der optischen Emissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES). Die Dicke des Graphenoxids betrug etwa 1 nm mit 1-2 atomaren Schichten und die laterale Größe lag im Bereich von 0,5 bis 5 μm.

Die Feldemissions-TEM-Analyse des Graphenoxid-Nanopulvers nach der Aerosolerzeugung ergab eine gestapelte Plättchenstruktur mit unterschiedlichen Dicken von 5,94 bis 209,1 nm (Abbildung 2). Darüber hinaus ergab die TEM-EDS-Analyse das Vorhandensein von zwei Elementen (d. h. C und O) (Abbildung 2). Tabelle 2 zeigt die Atomprozentsätze der wichtigsten Graphenoxidkomponenten auf der Grundlage der EDS-Analyse: Kohlenstoff (72,69%), Sauerstoff (27,31%).

Abb1
Abb. 1 Physikalisch-chemische Eigenschaften von Graphenoxid. XPS, Röntgenphotoelektronenspektroskopie; XRD, Röntgenbeugung; TGA, thermogravimetrische Analyse; FT-IR, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie; UV-vis, ultraviolett-sichtbare Spektroskopie.
Abb2
Abb. 2 Analyse von Graphenoxid mittels FE-TEM (AD) (Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskopie) (×100.000). (EF) EDS-Spektrometer (energiedispersive Spektroskopie).

Korona 1

Korona 3

 

Überwachungskammer und Graphenoxid-Verteilung

Die angestrebten Massenkonzentrationen von Graphenoxid-Nanopulver betrugen 0,625 mg/m 3 , 2,5 mg/m 3 und 10 mg/m 3 für die niedrigen, mittleren bzw. hohen Konzentrationen. Die in den Kammern mit niedriger, mittlerer und hoher Konzentration abgegebenen Massenkonzentrationen betrugen 0,76 ± 0,10, 2,60 ± 0,19 bzw. 9,78 ± 0,29 mg/m 3 (Tabelle 3). Die mit einem optischen Partikelzähler (OPC) gemessenen Partikelkonzentrationen in den Kammern betrugen 3,25 × 10 3 ± 1,18 × 10 2 , 6,30 × 10 3 ± 2,90 × 10 2 und 9,97 × 10 3 ± 1,68 × 10 3 Partikel/ cm 3 für die niedrige, mittlere bzw. hohe Konzentration (Tabelle 3). Die Partikelanzahlkonzentrationen wurden wie in Abbildung 3 dargestellt beibehalten.

Die Partikelgrößenverteilung in den Kammern wurde mit einem Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) (Bereich 5,94 nm - 224,7 nm) und OPC (Bereich 265 nm - 34 μm) gemessen. Das SMPS zeigte einen Peak bei 22,5 nm, 25 nm und 25,9 nm für die niedrigen, mittleren bzw. hohen Konzentrationen (Abbildung 4A), während das OPC einen Peak bei 265 nm, 365 nm bzw. 375 nm zeigte (Abbildung 4B). Der mit einem 13-stufigen MOUDI 125NR Kaskadenimpaktor gemessene mittlere aerodynamische Massendurchmesser (MMAD) betrug 203 nm mit einer GSD von 2,01 (Abbildung 5).

Abbildung 3
Abbildung 3: Partikelanzahlkonzentrationen in Graphenoxid-Aerosolen in Inhalationskammern während einer 5-tägigen Exposition, gemessen mit dem Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) (A) und dem Optical Particle Counter (OPC) (B)
Abbildung 4
Abbildung 4: Partikelgrößenverteilung von Graphenoxid-Aerosolen in Inhalationskammern, gemessen mit SMPS (A) und OPC (B). Die Verteilungen waren bimodal, mit Spitzenmaxima bei 20-30 nm (SMPS) und 300-400 nm (OPC), wie in Tabelle 3 dargestellt.
Abb 5
Abbildung 5: Mittlerer aerodynamischer Massendurchmesser (MMAD) (203 nm) und geometrische Standardabweichung (GSD) (2,01) von aerosoliertem Graphenoxid, gemessen mit MOUDI.

tisch 3

Elementare Kohlenstoffanalyse

Der Gesamt-EC betrug 0,18 ± 0,20 mg/cm 2 , 1,56 ± 0,54 mg/cm 2 , 3,34 ± 0,71 mg/cm 2 und 7,25 ± 1,14 mg/cm 2 für die Kontroll-, Niedrig-, Mittel- und Hochkonzentrationskammern (Tabelle 4).

tabelle 4

Tierbeobachtung, Futteraufnahme und Auswirkungen auf das Körper- und Organgewicht

Während der Exposition wurden keine signifikanten Bruttoeffekte beobachtet. Es wurden auch keine signifikanten Körpergewichtsverluste oder Veränderungen in der Nahrungsaufnahme während der Expositions- und Erholungsphase beobachtet (Tabelle S2 und 3). Allerdings war das Gewicht der rechten Lunge bei der hohen Konzentration nach einem Tag signifikant höher (P < 0,05), was eine weitere Überprüfung der Entzündung durch histopathologische Untersuchungen und Analysen der BAL-Zellen und BAL-Flüssigkeit nahelegt ( Tabelle S4 ).

Histopathologie

Während die Anzahl der Alveolarmakrophagen mit aufgenommenem Graphenoxid konzentrationsabhängig anstieg (Abbildung 6), wurde während des 21-tägigen Postexpositionszeitraums eine allmähliche Beseitigung von Graphenoxid beobachtet. Ungeachtet dessen blieben einige Makrophagen mit aufgenommenem Graphen auch am Tag 21 nach der Exposition bestehen (Abbildung 6, rote Pfeile).

Es wurden keine signifikanten histopathologischen Beobachtungen im Epithel der peripheren Atemwege, im interstitiellen Gewebe, im Alveolarraum oder im Gefäßsystem in Leber und Nieren festgestellt. Lichtmikroskopische Beobachtungen ergaben keine eindeutigen Hinweise auf eine Bewegung von Makrophagen, die Graphenoxid aufgenommen hatten, in die an die Bronchien angrenzenden Lymphknoten. Darüber hinaus gab es keine signifikante histopathologische Reaktion des Lungenparenchyms, und selbst bei geringer Vergrößerung wurde eine ausschließlich adaptive Reaktion der Lungenmakrophagen-Clearance festgestellt (Abbildung 7). Die histopathologische Untersuchung von Leber und Niere ergab keine signifikanten, durch den Testartikel verursachten Läsionen.

Abb 6
Abbildung 6: Histopathologie der Lunge nach 1, 3 und 21 Tagen. Die Tafeln sind als Tag nach der Exposition gegenüber der Konzentration angeordnet. Vergrößerung 400x. Keine der Mikroaufnahmen zeigte eine Entzündung in den Bronchiolen oder perivaskulären Regionen. Es gab keine fibrotischen Zellproliferationen im interstitiellen Gewebe. Makrophagen mit aufgenommenem Graphenoxid wurden in einer konzentrationsabhängigen Weise nachgewiesen. Während des gesamten Zeitraums nach der Exposition wurde bei verschiedenen Konzentrationen kein granulomatöses Erscheinungsbild beobachtet. Rote Pfeile zeigen Makrophagen mit aufgenommenem Graphenoxid an.
Abb 7
Abbildung 7: Histopathologie der Lunge nach 1, 3 und 21 Tagen. Die Felder zeigen mikroskopische Bilder der Kontrolle und der hohen Konzentration bei geringer Vergrößerung (100x). Keines der mikroskopischen Bilder zeigt eine Entzündung in den Bronchiolen oder perivaskulären Regionen oder im Lungenparenchym. Rote Pfeile zeigen Makrophagen mit aufgenommenem Graphenoxid an.
Messung von Entzündungsmarkern und Zytokinen

Die differenzielle Zellzahl in der BAL zeigte keine signifikanten Veränderungen in der Gesamtzahl der Zellen, Makrophagen, Lymphozyten oder PMN (Tabelle 5). Beim Vergleich der Entzündungsbiomarker in der BAL mit der Kontrollgruppe wurde am Tag 3 nach der Exposition ein signifikanter Anstieg von mTP in der Gruppe mit niedriger Konzentration beobachtet.

Auch hier zeigten alle exponierten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe zu jedem Zeitpunkt nach der Exposition eine konsistente signifikante Abnahme von mALB, aber keine signifikante Veränderung von BUN oder LDH. (Tabelle 6). Darüber hinaus zeigte die BAL-Flüssigkeit keine signifikanten Veränderungen der Zytokine IL-1β oder TNF-α während des Zeitraums nach der Exposition (Tabelle 6).

tabelle 5

tabelle 6

Wirkung auf die Blutgerinnung

Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte keine der exponierten Gruppen eine Veränderung der PT- und APTT-Blutgerinnungsmarker während des 21-tägigen Postexpositionszeitraums (Tabelle 7).

tabelle 7

Hämatologie und Blutbiochemie

Die mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC) zeigte einen signifikanten Rückgang (P < 0,01) in der Gruppe mit niedriger Konzentration nach einem Tag (Tabelle S7). Darüber hinaus zeigte die mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC) eine Abnahme (P < 0,05) in den Gruppen mit mittlerer und hoher Konzentration nach 3 Tagen, aber einen Anstieg (P < 0,05) in der Gruppe mit hoher Konzentration nach 21 Tagen (Tabelle S8-9). Das mittlere Thrombozytenvolumen (MPV) stieg in der Gruppe mit niedriger Konzentration nach einem Tag an (P < 0,01) (Tabelle S7).

Der Prozentsatz der nicht gefärbten Zellen (LUC) stieg ebenfalls (P < 0,01) in der Gruppe mit niedriger Konzentration nach einem Tag und stieg (P < 0,05) in den Gruppen mit niedriger und mittlerer Konzentration nach drei Tagen (Tabelle S7-8). Die absolute Zahl der großen ungefärbten Zellen (abs luc) nahm in der Gruppe mit mittlerer Konzentration nach 3 Tagen zu (P < 0,05) ( Tabelle S8). Während LUC über alle Zeitpunkte nach der Exposition einen konsistenten Trend zu signifikanten Erhöhungen zeigte, lagen diese Veränderungen alle innerhalb des normalen Bereichs der numerischen Kontrollwerte für diesen Endpunkt.

Die Gruppe mit mittlerer Konzentration wies einen niedrigeren Cholesterinspiegel (CHO) auf als die Gruppe mit niedriger Konzentration (p < 0,05) (Tabelle S10). Der Kreatinspiegel (CRE) sank ebenfalls (P < 0,05 - 0,01) in den Gruppen mit mittlerer und hoher Konzentration nach einem Tag (Tabelle S10). Anorganisches Phosphat (IP) nahm signifikant (P < 0,05 - 0,01) in allen exponierten Gruppen nach 1 Tag und in den Gruppen mit mittlerer und hoher Konzentration (P < 0,05) nach 3 Tagen ab ( Tabelle S10-11 ). Der Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Spiegel sank (P < 0,05) in der Gruppe mit hoher Konzentration nach 1 Tag und sank (P < 0,01) in den Gruppen mit mittlerer und hoher Konzentration nach 3 Tagen ( Tabelle S10-11). Die Gruppe mit hoher Konzentration wies auch einen niedrigeren LDH-Spiegel auf als die Gruppe mit niedriger Konzentration (p < 0,05) (Tabelle S10).

Der Magnesiumspiegel (MG) sank (P < 0,01) in den Gruppen mit mittlerer und hoher Konzentration nach einem Tag und sank (P < 0,01) in den Gruppen mit niedriger, mittlerer und hoher Konzentration nach drei Tagen. Die Gruppen mit mittlerer und hoher Konzentration wiesen auch einen niedrigeren MG-Wert auf als die Gruppe mit niedriger Konzentration (P < 0,01) (Tabelle S 10-12). Der Triglyceridspiegel (TG) stieg (p < 0,01) in der Gruppe mit niedriger Konzentration nach 1 Tag und stieg (P < 0,01) in der Gruppe mit hoher Konzentration nach 3 Tagen (Tabelle S10-11). Während die TG-Werte über alle Zeitpunkte nach der Exposition hinweg konsistent signifikante Anstiege aufwiesen, lagen diese Veränderungen innerhalb des normalen Bereichs der numerischen Kontrollwerte.

Der Spiegel der oxidativen Glutamat-Transaminase (GOT) sank (p < 0,01) in der Gruppe mit niedriger Konzentration nach einem Tag und stieg (p < 0,01) in der Gruppe mit hoher Konzentration nach drei Tagen (Tabelle S11). Die Gruppe mit hoher Konzentration wies auch eine niedrigere GOT auf als die Gruppe mit niedriger Konzentration (p < 0,05) (Tabelle S10). Der Kreatinkinase (CK)-Spiegel sank in den Gruppen mit mittlerer und hoher Konzentration nach 3 Tagen (p < 0,01) (Tabelle S11). Der Natriumspiegel (Na) sank in der Gruppe mit niedriger Konzentration nach 3 Tagen (P < 0,05) (Tabelle S11).

Der Albuminspiegel (ALB) und der Spiegel der alkalischen Phosphatase (ALP) sanken in den Gruppen mit mittlerer bzw. niedriger Konzentration nach 21 Tagen (P < 0,05) (Tabelle S12). Der Glukosespiegel (GLU) stieg in den Gruppen mit mittlerer und hoher Konzentration nach 21 Tagen an (P < 0,01) (Tabelle S12). Während jedoch konsistente signifikante Erhöhungen von IP, GOT, LDH, MG, CK zu allen Zeitpunkten nach der Exposition beobachtet wurden, lagen diese Veränderungen alle innerhalb des normalen Bereichs der numerischen Kontrollwerte ( Tabelle S10-11 ). Folglich wurden nach der Graphenoxid-Exposition keine signifikanten Auswirkungen von toxikologischer Bedeutung auf die hämatologische Funktion der Nieren und der Leber beobachtet.

Diskussion

Die Begriffe "sichere Innovation" und "sicheres Design" werden derzeit im Bereich der Nanotechnologie weithin verwendet, um Sicherheitsüberlegungen frühzeitig im Innovationsprozess von Nanomaterialien und nanofähigen Produkten zu fördern (Park et al., 2017). Graphen-Nanomaterialien sind in der Tat ein gutes Beispiel für eine sichere Innovation oder ein sicheres Design. Aufgrund des starken Interesses an der kommerziellen Entwicklung von Nanomaterialien aus Graphen und des zunehmenden Produktionstrends ist die Bewertung der damit verbundenen Risiken vor Beginn der Produktion sehr wichtig. Eine kürzlich durchgeführte Überprüfung von Studien zur Toxizität von Nanomaterialien auf Graphenbasis an Labortieren deutete auf potenzielle Verhaltens-, Reproduktions- und Entwicklungstoxizitäten sowie Genotoxizitäten hin (Ema et al., 2017).

Während die akute Inhalationstoxizität von Graphenoxid als gering beschrieben wurde (Han et al., 2015), ist die wiederholte Inhalationstoxizität von Graphenoxid noch nicht untersucht worden. Daher stellt die aktuelle Studie, die auf der Kurzzeit-Inhalationsstudie von Ma-hock et al. (2009) basiert, einen ersten Schritt bei der Gefahrenbewertung und der Ermittlung der Bandbreite für zukünftige subakute und subchronische Studien dar. Folglich zeigte die aktuelle Kurzzeit-Inhalationsstudie auf der Grundlage hämatologischer und biochemischer Analysen nach der Graphenoxid-Exposition und während eines Beobachtungszeitraums nach der Exposition keine signifikanten systemischen toxischen Wirkungen von Graphenoxid.

Die Ergebnisse zeigten auch einen ähnlichen Trend wie in einer früheren Studie zur subakuten Graphenexposition (Kim et al., 2016). Die histopathologische Untersuchung von Leber und Niere ergab keine signifikanten prüfkörperrelevanten histopathologischen Veränderungen. Darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede bei den bronchoalveolären Lavagezellen wie Lymphozyten, Makrophagen und PMNs festgestellt. Die Auswertung der Zytokine in der BAL-Flüssigkeit (d.h. IL-1β, TNF-α) zeigte ebenfalls keine signifikanten konzentrationsabhängigen Veränderungen während des Zeitraums nach der Exposition (Tabelle 6).Eine spontane Clearance-Reaktion der mit Graphenoxid infizierten Alveolarmakrophagen wurde in den Lungen aller Konzentrationsgruppen während des gesamten Zeitraums von 21 Tagen nach der Exposition beobachtet.

Tabelle 8 enthält einen Vergleich der Toxizitätsergebnisse für Graphen und Graphenoxid in verschiedenen Kurzzeit- und subakuten Inhalationsstudien mit Graphen. Die kurzfristige Graphen-Inhalationsstudie von Shin et al. (2015) und die subakute Graphen-Inhalationsstudie von Kim et al. (2016) wiesen nahezu identische Toxizitätsergebnisse auf wie die akute Graphenoxid-Inhalationsstudie von Han et al. (2015) und die aktuelle kurzfristige Graphenoxid-Inhalationsstudie. In einer anderen Studie zur pharyngealen Aspiration von Graphen-Nanoplättchen mit lateralen Größen von < 2, 5 und 20 µm wurden jedoch erhöhte Entzündungsmarker in BAL-Flüssigkeiten festgestellt, wenn Graphit-Nanoplättchen mit einer Größe von mehr als 5 µm verwendet wurden (Roberts et al., 2016).

Diese unterschiedlichen Ergebnisse könnten auf die laterale Größenverteilung von Graphen und Graphenoxid zurückzuführen sein. Wenn die laterale Größe weniger als 5 µm betrug, zeigten Alveolarmakrophagen, die mit Graphen und Graphenoxid abgebildet wurden, ähnliche Ergebnisse mit minimaler Toxizität. War die laterale Größe jedoch größer als 5 μm, löste Graphen nach der Exposition eine Entzündungsreaktion in der BAL-Flüssigkeit aus (Ma-hock et al., 2013). In den Studien von Shin et al. (2015) und Ma-hock et al. (2013) wurden die Tiere maximal 3 µg/m 3 bzw. 10 µg/m 3 durch Inhalation von Graphen-Nanoplättchen ausgesetzt und konnten sich 21 Tage lang erholen. Während die Graphen-Nanoplättchen-Aerosole in jeder Studie eine ähnliche MMAD aufwiesen, wurden die Entzündungsreaktionen durch die unterschiedlichen lateralen Größen der Graphen-Nanoplättchen bestimmt.

Darüber hinaus können auch unterschiedliche Verabreichungsmethoden die Entzündungsreaktion beeinflussen. Intratracheale Instillation (Shinwald et al., 2012) oder pharyngeale Aspirationstechniken für die Verabreichung in die Lungen von Ratten oder Mäusen können zu einer stärkeren Aggregation von Nanomaterialien führen und reproduzieren im Allgemeinen nicht genau die Ablagerungsmuster, die bei der Inhalationsexposition gegenüber trockenen aerosolisierten oder vernebelten Suspensionen von Nanomaterialien beobachtet wurden.

Der Hauptunterschied besteht darin, dass die Bolusexposition (Instillation oder Aspiration) eine nichtphysiologische Methode ist, um ein flüssig-suspendiertes Material innerhalb von Sekundenbruchteilen mit einer sehr hohen Dosisrate zu verabreichen, während die physiologische Inhalation aerosolisierte Materialien über einen längeren Zeitraum (Tage, Wochen oder Monate bei niedrigen Dosisraten) ablagert (Oberdorster et al., 2015). Daher wurde die Entzündungsreaktion, die nach intratrachealer Instillation von Graphenoxid und reduziertem Graphenoxid bei Mäusen mit einer erhöhten Akute-Phase-Reaktion zusammen mit Serum-Amyloid A (Bengston et al., 2017) ausgelöst wurde, in der aktuellen Inhalationsstudie nicht beobachtet, die keine ausgeprägte Entzündungsreaktion zeigte.

tabelle 8

Auf der Grundlage der Kurzzeit-Inhalationsstudie der Autoren wurde auch eine subchronische Inhalationsstudie mit Graphenoxid-Nanoplättchen durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass Makrophagen die Partikel in mäßigen und hohen Konzentrationen als spontane Reaktion auf die Clearance aufgenommen hatten. Daher betrug der vorgeschlagene NOAEL für die subchronische Inhalationsstudie 3,02 mg/m 3 und es wurden keine Zielorgane identifiziert ( An et al., 2017 ).

Die kürzlich überarbeiteten OECD-Prüfrichtlinien für subakute und subchronische Inhalationstoxizitätstests verlangen nun eine Analyse der Lungenexposition, um Informationen über die Ablagerung in der Lunge und den Verbleib der Partikel in der Lunge am Ende der Exposition und in den Beobachtungsintervallen nach der Exposition zu erhalten ( OECD 2017a ; 2017b ). In der aktuellen Studie wurden Messungen des elementaren Kohlenstoffs (EC) im Lungengewebe von 1 Tag bis 21 Tage verwendet, um Informationen zur Graphenoxid-Clearance zu erhalten. Es gab jedoch keine verfügbare Technologie zur Analyse von EC aus Lungengewebe. Diese Technologie wurde inzwischen von den jetzigen Autoren entwickelt und wird in unseren künftigen Inhalationsstudien mit Kohlenstoffnanomaterialien eingesetzt werden.

Referenzen

  • An K, Lee S, Sung J, Kim H, Lee J, Song K, 2017. Eine 90-tägige subchronische Inhalationstoxizitätsstudie von Graphenoxidpulver bei F344-Ratten . Toxikologe 2727 [  ]
  • Balapanuru J, Yang JX, Xiao S, Bao Q, Jahan M, Polavarapu L, et al. 2010. Ein ionischer Komplex aus Graphenoxid und organischem Farbstoff mit DNA-sensorischen und optisch einschränkenden Eigenschaften . Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49 :6549-53. [ PubMed ] [  ]
  • Bengston S, Knudsen KB, Kyjovska ZO, Berthing T, Skaug V, Levin M, Koponen IK, Shivayogimath A, Booth TJ, Alonso B, Pesquera A, Zurutuza A, Thomsen B, Troelsen JT, Jacobsen NR, Vogel U, (2017) Unterschiede in der Entzündungs - und Akute - Phase - Reaktion, aber ähnliche Genotoxizität bei Mäusen nach pulmonaler Exposition gegenüber Graphenoxid und reduziertem Graphenoxid. PLOS one 12 ( 6 ): e0178355. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Chang Y, Yang ST, Liu JH, Dong E, Wang Y. 2011. In-vitro-Toxizitätsbewertung von Graphenoxid auf A549-Zellen . Toxikologiebriefe 200 : 201-210. [ PubMed ] [  ]
  • Ema M., Gamo M., Honda K. (2017). Eine Übersicht über Toxizitätsstudien zu Nanomaterialien auf Graphenbasis bei Versuchstieren . Regulatorische Toxikologie und Pharmakologie 85 ( 2017 ) 7-24 [ PubMed ] [  ]
  • Han SG, Kim JK, Shin JH, Hwang JH, Lee JS et al. 2015a. Lungenreaktionen von Sprague-Dawley-Ratten bei einmaliger inhalativer Exposition gegenüber Graphenoxid-Nanomaterialien . Biomed res Fat 2015 : 376756 [ PMC freier Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • ISO TS 80004-3, 2010. Nanotechnologien-Vokabular - Teil 3: Kohlenstoff- Nanoobjekte . STANDARD von International Organization for Standardization (Technische Norm)
  • Kim JK, Shin JH, Lee JS, Hwang JH, Lee JH, Beak JE, Kim TG, Kim BW, Kim SK, Lee GH, Ahn KH, Han SG, et al. 2015. 28-Tage-Inhalationstoxizität von Graphen-Nanoplättchen bei Sprague-Dawley-Ratten Nanotoxikologie [ PubMed ]
  • Lee JH, Han JH, Kim JH, Kim BW. 2016. Expositionsüberwachung von Arbeitsplätzen zur Herstellung von Graphen-Nanoplättchen Inhal Toxicol 28 ( 6 ): 281-91 [ PubMed ] [  ]
  • Li Y, Wang Y, Liu T, Chen Di, Luo Zhi. 2016. Subakute Toxizitätsstudie von Graphenoxid bei der Sprague-Dawley-Ratte . Int. J. Umwelt. Res. Public Health 13 , 1149. [ PMC-freie Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Ma-Hock L, Burkhardt S, Strauss V, Gamer AO, Wiench K, van Ravenzwaay B, Landsiedel R. 2009. Entwicklung eines Kurzzeit-Inhalationstests an der Ratte mit Nano-Titandioxid als Modellsubstanz. Inhaliere Toxicol 21 :102-18. [ PubMed ] [  ]
  • Ma-Hock L, Strauss V, Treumann S, Kuttler K, Wohlleben W, Hofmann T, et al. 2013. Vergleichende Inhalationstoxizität von mehrwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen, Graphen, Graphit-Nanoplättchen und Ruß mit geringer Oberfläche . Teil Fiber Toxicol 10 : 23. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Mercer RR, Scabilloni JF, Hubbs AF, Battelli LA, McKinney W, Friend S, et al. 2013. Verteilung und fibrotische Reaktion nach inhalativer Exposition gegenüber mehrwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen . Teil Fiber Toxicol 10 : 33. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • MPPD (Multiple-Path Particle Dosimetry) Modell v.2.0, 2002. ARA, NM. Nationales Toxikologieprogramm, US-Gesundheitsministerium,  ]
  • NIOSH (Nationales Institut für Arbeitssicherheit und Gesundheitsschutz). 2003. Handbuch der Analysemethoden (NMAM) Methode 5040: Elementarer Kohlenstoff . Cincinnati, OH: NIOSH. [  ]
  • NIOSH (Nationales Institut für Arbeitssicherheit und Gesundheitsschutz). 2013. Current Intelligence Bulletin 65: Berufliche Exposition gegenüber Kohlenstoff-Nanoröhrchen und -Nanofasern . Cincinnati, OH: NIOSH. [  ]
  • Oberdorster G, Castranova V, Asgharian B, Sayre P, (2015). Inhalative Exposition gegenüber Kohlenstoffnanoröhren (CNT) und Kohlenstoffnanofasern (CNF): Methodik und Dosimetrie . J Toxicol Environ Health B Crit Rev . 2015; 18 ( 0 ): 121-212. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • OECD (Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung), (2017a). OECD-Richtlinie für die Prüfung von Chemikalien: 28-tägige (subakute) Inhalationstoxizitätsstudie, OECD, Paris [  ]
  • OEC; D (Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung), (2017b). OECD-Leitlinie für die Prüfung von Chemikalien: 90-tägige (subchronische) Inhalationstoxizitätsstudie, OECD, Paris [  ]
  • Park MVDZ, Bleeker EAJ, Brand W, Casse FR, van Elk M, Gosens I, de Jong WH, Meesters JAJ, Peijnenburg WJGM, Quik JTK, Vandebriel RJ, Sips AJAM (2017). Überlegungen für sichere Innovation: Der Fall von Graphen . ACS Nano 11 : 8574-9593 [ PubMed ] [  ]
  • Roberts JR, Mercer RR, Stefaniak AB, Seehra MS, Geddam UK, Chaudhuri IS, Kyrlidis A, Kodali VK, Sager T, Kenyon A, Bilgesu SA, Eye T, Scabilloni JF, Leonard SS, Fix NR, Schwegler-Berry D, Farris BY, Wolfarth MG, Porter DW, Castranova V, Erdely A. 2016. Bewertung der pulmonalen und systemischen Toxizität nach Lungenexposition gegenüber Graphit-Nanoplatten: ein Mitglied der Graphen-basierten Nanomaterialfamilie . Span- und Faser-Toxikologie , 13 : 34. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Sanchez VC, Jachak A, Hurt RH, Kane AB. 2012. Biologische Wechselwirkungen von Nanomaterialien der Graphenfamilie: eine interdisziplinäre Übersicht . ChemRes Toxicol 25 :15-34. [ PMC kostenloser Artikel ] [ PubMed ] [  ]
  • Schinwald A, Murphy F, Askounis A. Koutsos V, Sefiane K. Minimale Oxidation und Inflammogenität von reinem Graphen mit Aufenthalt in der Lunge . Nanotoxikologie 8 ( 8 ): 824-832. [ PubMed ] [  ]
  • Shin JH, Han SG, Kim JK, Kim BW, Hwang JH, Lee JS et al. 2015. 5-tägige Studie mit wiederholter Inhalation und 28-tägiger Postexpositionsstudie von Graphen . Nanotoxikologie 9 :1023-31. [ PubMed ] [  ]
  • Anxin Wang, Pu Kefeng, Dong Bing, Liu Yang. 2013. Rolle der Oberflächenladung und des oxidativen Stresses bei der Zytotoxizität und Genotoxizität von Graphenoxid gegenüber menschlichen Lungenfibroblastenzellen [ PubMed ]
  • Whalan JE, Foureman GL, Vandenberg JJ. 2006. Inhalationsrisikobewertung bei der Umweltschutzbehörde In: Salem H, Katz SA, Hrsg. Inhalationstoxikologie . 2. Aufl. Boca Raton, FL: CRC Press, 26-8. [  ]
  • Yang S, Brüller ZS, Wu Z, Liu K, Parvez R, Dong F, Richard P, Samori X, Feng K, Müllen K. 2015. Organische radikal-unterstützte elektrochemische Exfoliation für die skalierbare Produktion von hochwertigem Graphen. Marmelade. Chem.-Nr. Soc , 137 ( 43 ), S. 13927-13932 [ PubMed ] [  ]