Gibt es ein Patent für einen Co-Delivery-Impfstoff?


Patent: Herstellung und Anwendung eines Nano-Adjuvans von Pachyman und eines Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoffs auf der Basis von Graphenoxid im Bereich der Arzneimittel.

Beschreibung

Die Erfindung umfasst ein Nano-Adjuvans von Pachyman, das durch die Verwendung eines Nano-Graphenoxid-Materials als Träger und von auf den Träger geladenem Pachyman gebildet wird, sowie einen Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoff, der durch das Adjuvans und ein Antigen gebildet wird.

 

Das Nanometer-Adjuvans Pachyman kann die Reifung der dendritischen Zellen fördern, die Funktion der Lymphozyten verbessern, die Freisetzung des Medikaments erleichtern, die Wirkung des Medikaments effektiv verlängern, eine Immuntoleranz verhindern und die Immunwirkung sowie die Reaktionszeit erheblich verbessern.

Der Impfstoff mit Adjuvans/Antigen-Co-Delivery verbessert die Bioverfügbarkeit von Pachyman und Antigen, ermöglicht die Aufnahme von Antigen und Adjuvans durch dieselbe Zelle, verbessert die Targeting-Eigenschaft des Impfstoffs erheblich und kann nicht nur eine humorale Immunität, sondern auch eine stärkere zelluläre Immunität induzieren. Die Erfindung wird als neuartiges Adjuvans und als Impfstoff verwendet und kann voraussichtlich zur Vorbeugung und Behandlung menschlicher Krankheiten eingesetzt werden.

Technischer Bereich

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin und bezieht sich insbesondere auf ein Pachyman-Nano-Adjuvans auf der Basis eines Graphenoxid-Materials sowie ein Herstellungsverfahren und die Anwendung eines Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoffs, der durch das Pachyman-Nano-Adjuvans und ein Antigen gebildet wird.

Hintergrund

Die Entwicklung und Anwendung von Impfstoffen wurde von der Krankheitsvorbeugung auf die Behandlung zahlreicher nicht ansteckender Krankheiten ausgedehnt. Herkömmliche abgeschwächte Lebendimpfstoffe weisen im Allgemeinen eine hohe Immunogenität auf, bergen jedoch das Risiko einer Rückmutation, und die Immunwirkung hat gewisse Grenzen. Inaktivierte Impfstoffe, Subunit-Impfstoffe, DNA-Impfstoffe und rekombinante Impfstoffe sind relativ sicher, haben jedoch eine begrenzte Immunogenität und können durch die Zugabe von Adjuvantien eine langfristig wirksame Schutzwirkung entfalten.

Das Immunadjuvans kann als unspezifischer Immunpotentiator die immunologische Wirkung erheblich verstärken oder die Art der Immunantwort nach der Impfung verändern, indem es dem Körper im Voraus oder gleichzeitig mit einem Antigen injiziert wird. Seit der Zulassung des Aluminiumadjuvans im 20. Jahrhundert ist es das am häufigsten verwendete Adjuvans, das die primäre Immunität verstärken, die Antigendosis und die Häufigkeit der Immunisierung verringern kann, aber keine CTL-Antwort hervorrufen kann und verschiedene Nebenwirkungen verursachen kann.

Mit jahrzehntelanger Verzögerung wurde Ende der 90er Jahre des 20. Jahrhunderts die Öl-in-Wasser-Emulsion MF59 für das Inverkehrbringen zugelassen, und seit dem 21. Jahrhundert wurden nacheinander die Adjuvantien AS03, AS01, AS04 und CpG ODN zugelassen. Zusätzlich zu den wenigen oben genannten Impfstoffadjuvantien, die für die Verwendung beim Menschen zugelassen sind, befinden sich die meisten von ihnen noch in der klinischen oder präklinischen Erprobungsphase, und die Zahl der für die Verwendung beim Menschen verfügbaren Adjuvantien ist sehr begrenzt, so dass die Entwicklung neuer Adjuvantien dringend erforderlich ist.

Tuckahoe (Poria cos (Schw.) Wolf) ist ein langjähriges traditionelles chinesisches Arzneimittel und wird weithin für die Behandlung der traditionellen chinesischen Medizin verwendet. Poria cocos (Schw.) Wolf aus der Familie der Polyporaceae, Polyporus-Pilze, hat ein trockenes Sklerotium, das hauptsächlich an der Wurzel der Kiefer wächst. Die Wirkstoffe umfassen hauptsächlich: Polysaccharide, Alkaloide, Saponine, Terpene, Polyphenole usw.

Die Polysaccharide sind die Hauptbestandteile von Poria cocos, und das Pachyman ist eine Mischung aus verschiedenen Arten von Polysacchariden, die aus Poria cocos extrahiert und gereinigt wurden, und sein Gehalt beträgt etwa 84% des trockenen Sklerotiums von Poria cocos, und es umfasst wasserlösliche Polysaccharide und alkalilösliche Polysaccharide und besteht aus Glucose, Fucose, Arabinose, Xylose, Mannose und Galactose.

Zahlreiche Untersuchungen zeigen, dass Pachyman das Immunsystem stärkt, die Immunorgane von Organismen schützt, die Funktionen von T- und B-Zellen verbessert, die Aktivität von dendritischen Zellen und die Freisetzung bestimmter Zytokine beeinflusst und damit die spezifische und unspezifische Immunantwort fördert. Die geringe Toxizität und die geringen Nebenwirkungen von Pachyman machen es zu einem idealen immunologischen Adjuvans. Allerdings ist das Molekulargewicht von Pachyman groß und die Freisetzung des Wirkstoffs erfolgt zu schnell, was zu einer übergroßen Injektionsdosis führen kann, wodurch die klinische Anwendung von Pachyman erschwert wird. Daher ist es dringend erforderlich, dieses Problem zu lösen.

Nanomaterial bezieht sich auf Einkristalle oder polykristalline Körper mit einer Korngröße von weniger als 100 nm. Die Nanopartikel haben die biologischen Eigenschaften, dass sie leicht von verschiedenen Zellen aufgenommen werden und von Antigen-präsentierenden Zellen phagozytiert werden können, so dass die durch Antigene ausgelöste Immunantwort verstärkt wird. Das Nanomaterial kann das Antigen auch langsam freisetzen, die Dosierung oder die Zeiten des Antigens reduzieren, die Größe des niedermolekularen Antigens erhöhen und das Antigen vollständig verarbeiten und behandeln, so dass die Immunwirkung dauerhafter ist.

Einige Nanopartikel haben selbst eine stimulierende Wirkung auf das Immunsystem, und eine Immunisierung mit Impfstoffen, die Nanomaterialien enthalten, kann zu einer Immunreaktion in der Schleimhaut und im Magen-Darm-Trakt führen. Graphen ist ein Kohlenstoff-Nanomaterial mit einer zweidimensionalen, ebenen Struktur, und die spezielle monoatomare Schichtstruktur des Graphens ermöglicht eine Vielzahl einzigartiger physikalisch-chemischer Eigenschaften des Graphens.

Graphenoxid ist ein Oxid von Graphen, und da Graphenoxid nach der Oxidation mehr sauerstoffhaltige funktionelle Gruppen enthält, können die Eigenschaften von Graphenoxid durch verschiedene Reaktionen mit den sauerstoffhaltigen funktionellen Gruppen verbessert werden. Das Graphenoxid und seine Derivate haben die Vorteile einer hohen spezifischen Oberfläche, einer starken elektrischen und thermischen Leitfähigkeit, einer guten Biokompatibilität und dergleichen und finden breite Anwendung in den biomedizinischen Bereichen der Medikamententräger, der Krebserkennung und -behandlung und dergleichen.

Daher ist es notwendig, Pachyman als Rohstoff auszuwählen, eine Graphenoxid-Beschichtungsmethode anzuwenden, das Medikament langsam freizusetzen, die Dosierung des Pachyman zu reduzieren und einen wirksamen, sicheren und stabilen Immunopotentiator, nämlich das Pachyman-Nano-Adjuvans auf der Grundlage des Graphenoxid-Materials, zu finden.

Offenlegung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein Pachyman-Nano-Adjuvans und einen Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoff bereit, der durch das Adjuvans gebildet wird. Das Pachyman-Nanometer-Adjuvans kann die Immunwirkung von Impfstoffen erheblich verstärken, die Dosierung von Pachyman reduzieren, die Dosierung von Impfstoff-Antigenen reduzieren, nachdem die Antigene eingekapselt sind, und verschiedene begrenzte Probleme bei der klinischen Anwendung in der bisherigen Technik lösen.

Die Erfindung stellt auch ein Pachyman-Nano-Adjuvans und ein Herstellungsverfahren für den Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoff bereit, der durch das Adjuvans gebildet wird, und das Herstellungsverfahren ist einfach und leicht zu handhaben, hat eine offensichtliche Wirkung und eignet sich für die Produktion in großem Maßstab.

Um diesen Zweck zu erreichen, sieht die Erfindung das folgende technische Schema vor:

Die Erfindung stellt ein Pachyman-Nano-Adjuvans bereit, wobei ein Trägermaterial des Pachyman-Nano-Adjuvans Nano-Graphenoxid ist und Pachyman mit einem Nano-Graphenoxid-Träger verbunden ist, um das Pachyman-Nano-Adjuvans auf der Basis eines Graphenoxid-Materials zu bilden. Das erfindungsgemäße Pachyman-Nanohilfsmittel kann Pachyman mit hoher Effizienz laden und löst die klinischen Anwendungsprobleme der schnellen Freisetzung von Pachyman-Medizin und der übergroßen Injektionsdosis.

Das Nano-Graphenoxid ist ein Graphenoxid, das mit einer Nanomethode behandelt wurde, mehr sauerstoffhaltige funktionelle Gruppen aufweist und ein Nanomaterial mit hoher spezifischer Oberfläche und guter Biokompatibilität ist. Die Partikelgröße beträgt 1-100 nm, das Molekulargewicht liegt bei 5-10 kDa, der Träger kann in die Lymphknoten eindringen und dort wirken, und der Träger findet breite Anwendung im Bereich der Träger von Medikamenten und Impfstoffen.

Das Molekulargewicht des Pachymans beträgt 8-15 kDa, die konstitutionellen Monosaccharide des Pachymans umfassen Glucose, Mannose, Fucose, Galactose und dergleichen, und das Massenverhältnis der konstitutionellen Monosaccharide beträgt (2-3,5): (1-2): (0.3-4): 1.

Das Massenverhältnis von Nano-Graphenoxid zu Pachyman beträgt 1: 2,5-1: 10, vorzugsweise 1: 5.

Die bevorzugte Teilchengröße des Pachyman-Nanometer-Hilfsstoffs beträgt 100-500 nm und das Molekulargewicht 15-45 kDa.

Ein Verfahren zur Herstellung eines Pachyman-Nanometer-Adjuvans umfasst die folgenden Schritte:

(1) Auflösen und Dispergieren von Graphenoxid unter Verwendung von sterilem Wasser, Durchführen einer Ultraschallbehandlung für 2 Stunden, Durchführen einer Eisbad-Ultraschallbehandlung für 30 Minuten, Zugeben von Natriumhydroxid (die Endkonzentration ist 5M) und Fortsetzen der Ultraschallbehandlung für 2 Stunden; Zentrifugieren bei einer hohen Geschwindigkeit von 16.000g der Superschwerkraft und Sammeln des Überstandes, um eine Nano-Graphenoxid-Trägerlösung zu erhalten, wobei die Endkonzentration der Nano-Graphenoxid-Trägerlösung 0.1-10 mg/ml, und vorzugsweise 1 mg/ml, beträgt;

(2) und (3) Durchführung einer Ultraschallbehandlung der Nano-Graphenoxid-Lösung in Schritt (1) für 1 Stunde und Einstellung des pH-Werts auf 9-10, vorzugsweise 9,5. Zugabe von Epoxychlorpropan, Einleiten von Stickstoff für die Reaktion, Rühren und Reagieren für 4 Stunden bei einer Temperatur von 40 ℃ im Wasserbad und Dialyse zur Entfernung von nicht umgesetztem Epoxychlorpropan;

(3) Herstellen einer Pachymaran-Lösung mit deionisiertem Wasser und Durchführen einer Endotoxin-entfernenden Affinitätschromatographie-Behandlung, wobei der Endotoxin-Gehalt weniger als 5EU/mL beträgt und die Konzentration der Pachymaran-Lösung 2-20 mg/mL, vorzugsweise 5 mg/mL beträgt.

(4) und (3) Lösen der Pachymaran-Lösung in der Nano-Graphenoxid-Lösung in Schritt (2), Einstellen des pH-Werts auf 9-10, vorzugsweise 9, Durchführen eines Wasserbads bei 42 ℃ für 1-3 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden, und Zentrifugieren und Sammeln, um das Pachymaran-Nano-Adjuvans zu erhalten, das das Nano-Graphenoxid trägt.

Das Pachymaran-Adjuvans, das nach einer der Zubereitungsmethoden hergestellt wird, fällt ebenfalls unter den Schutzbereich der Erfindung.

Die Erfindung stellt auch einen Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoff bereit, der durch Beladen des Nano-Adjuvans Pachyman mit einem Virusantigen hergestellt wird. Das Antigen und Pachyman des Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoffs sind beide mit Graphenoxid verbunden. Die Partikelgröße des Impfstoffs beträgt 50 nm-1000 nm, und der absolute Wert des Zetapotenzials liegt bei 20-30 mv.

Die viralen Antigene umfassen: Das Virusantigen ist eines der folgenden: inaktiviertes EV71-Virus, inaktiviertes Hepatitis-A-Virus, inaktiviertes Poliovirus, inaktiviertes Influenzavirus, HPV-virusähnliche Partikel, hepatitis-B-virusähnliche Partikel oder rekombinante Proteine, die die Virusantigene enthalten.

Das Massenverhältnis von Nano-Graphenoxid zu Pachyman beträgt 1: 2,5-1: 10, vorzugsweise 1: 5.

Das Massenverhältnis des Virusantigens zum Pachyman beträgt 1: 2-1: 50, vorzugsweise 1: 25.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoffs umfasst die folgenden Schritte:

(1) Auflösen von Graphenoxid in sterilem Wasser, Durchführen einer Ultraschallbehandlung für 2 Stunden, Durchführen einer Eisbad-Ultraschallbehandlung für 30 Minuten, Zugeben einer starken Base, Durchführen einer kontinuierlichen Ultraschallbehandlung für 2 Stunden, Durchführen einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei einer Hypergravitation von 16.000 g und Sammeln des Überstandes, um eine Nano-Graphenoxid-Trägerlösung zu erhalten, wobei die Endkonzentration der Nano-Graphenoxid-Trägerlösung 0,1-10 mg/ml beträgt. Vorzugsweise 1 mg/ml.

(2) Ultraschallbehandlung der Nano-Graphenoxid-Lösung aus Schritt (1) für 1 Stunde, Einstellen des pH-Werts auf 9-10, vorzugsweise 9,5, Zugabe von Epoxychlorpropan, Einleiten von Stickstoff für die Reaktion, Rühren und Reagieren bei einer Temperatur von 40 ℃ in einem Wasserbad für 4 Stunden und Dialyse zur Entfernung von nicht umgesetztem Epoxychlorpropan;

(3) Herstellen einer Pachyman-Lösung mit deionisiertem Wasser und Durchführen einer Endotoxin-Entfernungsbehandlung, wobei die Konzentration der Pachyman-Lösung 2-20 mg/ml und vorzugsweise 5 mg/ml beträgt.

(4) Und (3) Auflösen der Pachymaran-Lösung in Schritt (3) in der Nano-Graphenoxid-Lösung in Schritt (2), Einstellen des pH-Werts auf 9-10, vorzugsweise 9, Durchführen eines Wasserbads bei 42 ℃ für 1 bis 3 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden, und Zentrifugieren und Sammeln, um das mit Nano-Graphenoxid beschichtete Pachymaran-Nanohilfsmittel zu erhalten.

(5) Einstellen des pH-Wertes der Pachyman-Nano-Adjuvans-Lösung, die Nano-Graphenoxid in Schritt (4) trägt, auf 4,5-7,2, vorzugsweise 6; Zugeben von EDC und Sulfo-NHS und Mischen für 15 min-1 h, vorzugsweise 30 min; Einstellen des pH-Wertes auf 7-8, vorzugsweise 7,2, Zugeben einer Virus-Antigen-Lösung, Mischen für 1-5 h, vorzugsweise 2 h, Entsalzen durch eine Entsalzungssäule, um einen Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoff zu erhalten;

in Schritt (4) beträgt das EDC/Sulfo-NHS-Molverhältnis 1: 2-10: 1, vorzugsweise 4: 1. Das Konzentrationsverhältnis von EDC zu Graphenoxid beträgt 1: 5-1: 20, vorzugsweise 1: 10.

in Schritt (4) beträgt die Konzentration der Virusantigenlösung 0,1-20 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml.

Die Verwendung des oben beschriebenen Antigen/Adjuvans-Co-Delivery-Impfstoffs bei der Herstellung eines Arzneimittels fällt ebenfalls in den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung. Zur Verwendung auf dem Gebiet der prophylaktischen und therapeutischen Impfstoffe.

Die Rohstoffe des erfindungsgemäßen Kits sind im Handel erhältlich; für die Geräte, Bedingungen (Temperatur, Zeit usw.), Stoffe, Mengen, Verfahren usw., die in der vorliegenden Erfindung nicht speziell beschrieben sind, können alle auf dem Gebiet der Technik bekannten oder allgemein bekannten Methoden verwendet werden, um sie zu bestimmen.

Im Vergleich zum Stand der Technik hat die Erfindung folgende Vorteile:

1. Die Herstellung des pachyman nano Adjuvans ist nicht im In- und Ausland berichtet, und die Erfindung stellt ein Herstellungsverfahren des pachyman nano Adjuvans auf der Grundlage eines Graphenoxid-Materials und optimierte Bedingungen davon.

2. Über die immunverstärkende Wirkung des Pachymaran-Nanometer-Adjuvans wird nicht berichtet. Die Umsetzung der Erfindung beweist, dass die immunologische Wirkung ist stark verbessert, nachdem die pachyman ist in der pachyman Nanometer Adjuvans, die durch die Stimulierung der dendritischen Zellen von Mäusen zu reifen in vitro und induzieren TH1-Typ Immunantwort ausgedrückt wird vorbereitet. Das Pachyman-Nano-Adjuvans bietet daher Materialien und Anschauungsmaterial für die Entwicklung neuartiger Adjuvantien.

3. Der Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoff, der das erfindungsgemäße Pachyman-Nano-Adjuvans enthält, hat eine hohe Stabilität, verbessert die Bioverfügbarkeit von Pachyman und Antigen erheblich, ermöglicht die Aufnahme des Antigens und des Adjuvans durch dieselbe Zelle, verbessert die Targeting-Eigenschaft des Impfstoffs, kann die TH1-Typ-Immunantwort verstärken und hat die Vorteile einer starken Persistenz der Immunantwort, einer guten Immunwirkung, einer erhöhten Zytokinsekretion und dergleichen.

Zeichnungen

Abbildung 1: zeigt den Herstellungsprozess von Pachyman Nano Adjuvans und Adjuvans Antigen Co-Delivery Impfstoff.

Abbildung 2: zeigt das Zeta-Potenzial des Nano-Adjuvans Pachyman.

Abb. 1,2

 

ABB. 3: zeigt die Elektronenmikroskopie des Nanoadjuvans Pachyman.

Abbildung 4: zeigt, dass der Nano-Adjuvans-Impfstoff Pachyman von dendritischen Zellen aufgenommen wurde.

Abb. 3
Abb. 4

 

Abbildung 5: zeigt, dass der nano-adjuvante Impfstoff Pachyman die Expression von CD86 in den BMDC erhöht.

Abb. 5

 

Abbildung 6: zeigt, dass der Nano-Adjuvans-Impfstoff Pachyman die CD80-Expression von BMDC hochreguliert.

Abbildung 7: zeigt, dass der nano-adjuvante Impfstoff Pachyman die MHCII-Expression von BMDC hochreguliert.

Abb. 6, 7

 

Abbildung 8: zeigt, dass der Nano-Adjuvans-Impfstoff Pachyman nach der Immunisierung von Mäusen die Produktion antigenspezifischer IgG-Antikörper auslöste.

ABB. 9: zeigt, dass der Pachymaran-Nanometer-Adjuvans-Impfstoff nach der Immunisierung von Mäusen Milzzellen zur Sekretion von IFN-gamma-Zytokinen veranlasst.

FIg. 8, 9

 

ABB. 10: zeigt, dass die IL-4-Zytokinsekretion durch Splenozyten nach Immunisierung von Mäusen mit dem Pachymaran-Nanometer-Adjuvans-Impfstoff induziert wurde.

Abb. 10

 

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die unter anderem die folgenden Beispiele umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.

Die in den folgenden Beispielen verwendeten experimentellen Verfahren sind alle konventionell, sofern nicht anders angegeben.

Die in den folgenden Beispielen verwendeten Materialien, Reagenzien und dergleichen sind, sofern nicht anders angegeben, im Handel erhältlich.

Beispiel 1

Die Ausführungsform ist ein Verfahren zur Herstellung des Pachyman-Nano-Adjuvans auf der Grundlage des Graphenoxid-Materials und des Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoffs, der durch das Adjuvans gebildet wird.

Die Zubereitungsmethode umfasst die folgenden Schritte:

(1) Auflösen von Graphenoxid in sterilem Wasser, Durchführung einer 2-stündigen Ultraschallbehandlung, Durchführung einer 30-minütigen Eisbad-Ultraschallbehandlung, Zugabe einer starken Base und Durchführung einer 2-stündigen Ultraschallbehandlung. Zentrifugieren bei einer hohen Geschwindigkeit von 16.000 g und Auffangen des Überstandes, um eine Nano-Graphenoxid-Trägerlösung mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml zu erhalten.

(2) Und (2) Durchführung einer Ultraschallbehandlung der Nano-Graphenoxid-Lösung in Schritt (1) für 1 Stunde, Einstellen des pH-Werts auf 9,5, Zugabe von Epoxychlorpropan, Einleiten von Stickstoff für die Reaktion, Rühren in einem Wasserbad bei 40 ℃ für die Reaktion für 4 Stunden und Dialyse, um das nicht umgesetzte Epoxychlorpropan zu entfernen.

(3) Zubereitung der Pachyman-Lösung mit deionisiertem Wasser und Entfernung des Endotoxins, um eine Pachyman-Lösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml zu erhalten.

(4) und (3) Lösen der Pachymaran-Lösung in Schritt (3) in der Nano-Graphenoxid-Lösung in Schritt (2), Einstellen des pH-Werts auf 9, Durchführen eines Wasserbads bei 42 ℃ für 3 Stunden und Durchführen einer Zentrifugalsammlung, um das mit Nano-Graphenoxid beschichtete Pachymaran-Nanohilfsmittel zu erhalten.

(5) Und (4) Einstellung des pH-Werts der Pachyman-Nanometer-Hilfsstofflösung, die das Nanometer-Graphenoxid aus Schritt (4) enthält, auf 6. Ligations-EDC und Sulfo-NHS wurden hinzugefügt und 30 Minuten lang gemischt. Einstellung des pH-Werts auf 7, Zugabe einer Virus-Antigen-Lösung, Mischen für 2 Stunden, Entsalzen durch eine Entsalzungssäule, um einen Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoff zu erhalten;

Das Verfahren zur Herstellung des leeren Graphenoxid-Trägers ist das gleiche wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass Pachyman und Antigen nicht hinzugefügt werden.

Beispiel 2

Das Konstruktionsschema des Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoffs auf der Grundlage des Nano-Adjuvans Pachyman ist in Abbildung 1 dargestellt,

Beispiel 2: Charakterisierung von Adjuvans/Antigenen Gemeinsam verabreichte Impfstoffe mit dem Adjuvans Pachymaran Nano

(1) Messung des Zeta-Potenzials der Oberfläche

Pachymaran-Nanoadjuvans/Antigene, die gemeinsam mit dem Impfstoff verabreicht wurden, wurden in einer Konzentration von 0,1 mg/ml mit Milli-Q Reinstwasser hergestellt. 1 ml der Probenlösung wurde zur Bestimmung des Oberflächen-Zetapotenzials der Nanopartikel mit einem Zetapotenzial-Analysator (Malvern, UK, Zetasizer NanoZS) verwendet. Die Temperatur wird vor jeder Bestimmung 20 Minuten lang gehalten, jede Probe wird dreimal getestet, das Ergebnis wird gemittelt, das Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt, und der absolute Wert des Zetapotenzials beträgt mehr als 20 Mv, was darauf hinweist, dass die Probe relativ stabil ist.

(2) Beobachtung mit dem Transmissionselektronenmikroskop

Eine Pachyman-Nano-Adjuvans/Antigen-Co-Delivered-Impfstoff-Probenlösung mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml wird mit Milli-Q Reinstwasser präzise hergestellt. 10-20 ml der Probenlösung werden auf ein 230-Maschen-Kupfernetz getropft, das einen Kohlenstoffträgerfilm enthält, und nach dem Trocknen bei konstanter Temperatur wird die Morphologie der Probe mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM, FEI in USA, Tecnai G220S-TWIN, 200kV) beobachtet (Abbildung 3).

(3) Studien zur Stabilität von Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoffen

Das Zeta-Potenzial eines Adjuvans/Antigen-Ko-Vakzins, der eine angemessene Menge an Pachyman-Nano-Adjuvans enthält, wird mit einem Laser-Partikelmessgerät gemessen, dieselbe Charge Adjuvans/Antigen-Ko-Vakzins wird nach zwei Wochen entnommen, das Zeta-Potenzial wird mit derselben Methode gemessen, es gibt keinen offensichtlichen Unterschied, und der erfindungsgemäße Adjuvans/Antigen-Ko-Vakzin ist stabil.

(4) In-vitro-Verabreichung von Arzneimitteln

Es wird eine geeignete Menge eines Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoffs genommen, der das Adjuvans Pachyman nano enthält, wobei ein Modus-Antigen OVA durch FITC markiert wird und dann in DC2.4 Maus dendritischen Zellen, nach der Kultivierung für 6h, die Zellen sind fixiert, DAPI wird angenommen, um Zellkerne zu färben, Fluoreszenz wird unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, wie in Abbildung 4 gezeigt, grüne Fluoreszenz Ausdruck außerhalb der Zellkerne zu sehen ist, ein Teil der dendritischen Zellen nehmen das Antigen, und die Adjuvans / Antigen Co-Delivery-System kann das Antigen in die Zellen zu tragen.

(5) Messung der Medikamentenbelastung

Entnahme einer geeigneten Menge eines Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoffs, der Pachyman-Nano-Adjuvans enthält, und Messung der Beladungskapazität des Antigenproteins unter Verwendung einer BCA-Methode, wobei die Beladungskonzentration des Antigenproteins 0,5 mg/ml beträgt und die Medikamentenbeladungskapazität gut ist.

Beispiel 3

(a) Der in Beispiel 1 hergestellte Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoff, Pachyman, der in Beispiel 1 hergestellte leere Nano-Graphenoxid-Träger, das Modellantigen und die PBS-Lösungsgruppe wurden als Negativkontrolle (PBS) verwendet, um dendritische Zellen (BMDC) aus Mäuseknochenmark zu behandeln, und die Wirkung der Negativkontrolle auf die Reifung von dendritischen Mäusezellen in vitro wurde wie folgt untersucht:

Weibliche C57/BL6-Mäuse der SPF-Klasse wurden für 6-8 Wochen ausgewählt.

(1) Aufbereitung von Knochenmarkzellen

Tötung einer Maus durch zervikale Dislokation, Abscheren von Haut und Haaren der Maus, Entnahme des Oberschenkelknochens, Einweichen in 70%-Alkohol für 2-5 Minuten, Überführung in ein RPMI1640-Vollserum-Kulturmedium (auf Eis), vorsichtiges Abscheren der beiden Enden des Oberschenkelknochens, Aufsaugen von jeweils 100-200 mu l RPMI1640 mit einer Spritze und wiederholtes Spülen des Knochenmarks in ein steriles Röhrchen mit RPMI1640, bis der Knochen vollständig weiß ist. Die Knochenmarkspülung wurde aus dem Röhrchen in eine Petrischale mit RPMI1640-Vollserum durch Filtration durch ein 200-Mesh-Nylonnetz überführt. Kultivierung in der Zellkulturbox für 30 Minuten. Die nicht oder nur wenig adhärenten Zellen wurden gesammelt, auf 1X106 Zellen/ml eingestellt, 20ng/ml GM-CSF zugegeben und ausplattiert.

(2) Kultur von aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen

Am nächsten Tag der Knochenmarkzellkultur wurde die Flüssigkeit teilweise gewechselt und neues GM-CSF-haltiges RPMI1640-Vollserummedium zugegeben. Am dritten Tag wurde die Lösung vollständig ausgetauscht, der Zellüberstand wurde abgesaugt, die nicht adhärenten Zellen wurden vorsichtig abgewaschen, und in jede Vertiefung wurde ein neues RPMI1640-Vollserummedium mit GM-CSF zugegeben. Am vierten oder fünften Tag wurden die nicht oder nur lose haftenden Zellen durch Waschen gesammelt und die haftenden Zellen verworfen. Am sechsten oder siebten Tag, nach 48 Stunden Kultur, wurden unreife BMDCs für weitere Tests entnommen.

(3) Durchflusszytometrie zur Bestimmung der Zelloberflächen CD80 und CD86, MHCII

Unreife BMDCs wurden gesammelt und mit einer Zellkonzentration von 1X 106/ml in 24-Well-Platten ausgesät. Jeweils Zugabe von Pachymaran, Adjuvans/Antigen-Co-Delivery-Impfstoff, Graphenoxid-Träger, Modell-Antigen und PBS, Behandlung für 24 Stunden, Sammeln von unvollständig angehefteten Zellen, Versiegeln für 30 Minuten mit Anti-Maus-CD16/32-Antikörper, Zugabe von APC Anti-Maus-CD80, PE/Cy7 Anti-Maus-CD86 und PE Anti-Maus-MHC II-Antikörper, und Färbung für 30 Minuten bis 1 Stunde bei 4 ℃ an einem dunklen Ort. Und das Sammeln von Zellen, und die Erkennung durch ein Durchflusszytometer.

Die experimentellen Ergebnisse sind in Abb. 5-7 dargestellt. Der Graphenoxid-Träger hat keinen signifikanten Einfluss auf die Expression von BMDC-Oberflächenmarkermolekülen, und Pachyman kann CD86 und MHCII-Moleküle auf der BMDC-Oberfläche signifikant hochregulieren. Mit Adjuvant/Antigen ko-verabreichte Impfstoffe können die BMDC-Reifung in vitro wirksam induzieren.

Beispiel 4

(a) Der in Beispiel 1 hergestellte Adjuvans/Antigen-Ko-Impfstoff, Pachyman, Modellantigen und die PBS-Lösungsgruppe wurden als Negativkontrolle (kurz PBS) verwendet, um Mäuse zu immunisieren, und der Einfluss der Negativkontrolle auf die zelluläre Immunität der Maus und die humorale Immunität in vivo wurde wie folgt untersucht:

c57BL/6-Mäuse (weiblich, 6-8 W) wurden am Tag D0 subkutan immunisiert, und jede Gruppe wurde mit PBS, Modellantigen (10 μ g), Pachyman (500 μ g) oder einem gemeinsam verabreichten Impfstoff, der 10 mg Modellantigen enthält, geimpft. Das Blut wird nach 2 Wochen zur Lagerung entnommen, die Booster-Immunisierung wird einmal durchgeführt, die Mäuse werden nach 4 Wochen getötet, und das Blut wird zum Nachweis des spezifischen IgG-Antigens des Serum-Antimodalantigens OVA der Mäuse entnommen.

Die Milz wird entnommen, mit einem 70-mm-Zellsieb zerkleinert und mit PBS/EDTA gewaschen, um die Milzzellensuspension herzustellen. Nach dem Zählen der Zellen werden die Zellen in eine 96-Well-Platte (2 × 105/Well) gegeben, 300 μg/ml Musterantigenlösung hinzugefügt, 72 Stunden lang kultiviert, der Zellüberstand gesammelt und der Gehalt an IFN-gamma- und IL-4-Zytokinen im Zellüberstand mittels ELISA bestimmt.

Wie Abbildung 8 zeigt, erhöhte der gemeinsam mit dem Adjuvans und dem Antigen verabreichte Impfstoff die Expression der Musterantigen-spezifischen IgG-Antikörper im Mäuseserum im Vergleich zur Kontrollgruppe erheblich, was darauf hindeutet, dass die humorale Immunität gefördert werden konnte.

Der gemeinsam mit dem Adjuvans/Antigen verabreichte Impfstoff steigerte die IFN-γ-Sekretion von Mäusesplenozyten im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant, was darauf hindeutet, dass die zelluläre Immunantwort verstärkt werden konnte (Abb. 9-10).

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